植物栓塞修復機制與質膜內在水通道蛋白基因的克隆、表達和轉基因研究.pdf

1、水分是影響植物生長發(fā)育的五大關鍵因子之一，在植物生長發(fā)育過程中需要消耗大量的水分。植物體內水分的長距離運輸是通過木質部導管或管胞系統(tǒng)進行的，所以木質部栓塞會降低或阻斷水分長距離運輸。細胞膜上的水通道蛋白決定了水分的跨細胞移動，根系吸收的水分絕大部分是通過水通道蛋白進行，經(jīng)過具有凱氏帶的內皮層進入中柱的導管或管胞，最終運輸?shù)角o、葉。在木質部韌皮薄壁細胞中發(fā)現(xiàn)大量的水通道蛋白，它們不參與長距離水分運輸。然而，它們是否參與木質部栓塞修復？迄今

2、為止，其仍鮮有報道；另外，關于水通道蛋白在整個植物生長發(fā)育過程所扮演的角色也值得進一步探究。
　　本研究以84K楊（Poplus alba× Poplus. glandulosa）為試材，對其木質部栓塞修復機制進行初步探討。并利用基因工程技術，成功克隆了PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP1;5，PtPIP2;1，PtPIP2;2，PtPIP2;3，PtPIP2;4，PtPIP2;7和PtPIP2;8這9個PtPIPs基

3、因的cDNA全長，構建了其中5個水通道蛋白基因的植物表達載體，獲得84K楊和擬南芥的轉基因植株，旨在探討水通道蛋白在植物生長發(fā)育過程所起的作用。主要研究結果如下：
　　1.84K楊木質部栓塞的修復是從上方和下方兩個方向同時進行，其木質部栓塞的修復是根系壓力和導管周邊薄壁細胞中的水通道蛋白共同作用的結果。
　　2.84K楊的栓塞和氣孔導度表現(xiàn)出“疲勞”反應，受過脅迫的苗木對溫度和濕度更為敏感，其木質部的栓塞脆弱性更大、氣孔更為

4、敏感。
　　3.在干旱環(huán)境下，84K楊苗木具有較好的自我保護機制。在整個實驗過程中，84K楊可以有效保護光合器官免受非可逆性損傷，最大光量子效率PSII（Fv/Fm）一直保持在0.8左右，植物處于健康生長狀態(tài)。
　　4.應用geNorm、NormFinder和BestKeeper3個軟件統(tǒng)計分析，通過Real-timePCR技術，篩選得到干旱-復水處理過程中84K楊木質部薄壁細胞中表達量穩(wěn)定性較好的內參基因：EIF-5A、E

5、F4-L、UBQ和84K楊根系、木質部薄壁細胞、葉片三個組織中表達量穩(wěn)定性較好的內參基因：EIF-5A、CYP、UBQ。
　　5.應用各種生物信息學工具對PtPIPs基本物理性質、疏水性、跨膜結構域、功能及其功能位點進行預測分析，結果表明PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP2;3，PtPIP2;7和PtPIP2;8基因序列與MIP保守區(qū)序列一致，且含有植物質膜內在蛋白C環(huán)和E環(huán)的特征信號序列，具有與孔道形成有關的高度保守

6、單元；其編碼的蛋白質為穩(wěn)定的疏水性蛋白，跨膜結構域具有典型5個短環(huán)相連的6個親水的跨膜區(qū)且分布基本對稱。值得指出的是PtPIP2;7和PtPIP2;8不符合N-末端和C-末端位于細胞質一側的特點；PtPIP1;3含有1個微體C-末端定位信號，PtPIP2;8（285-287）含有1個糖基化位點，其結構特異性可能意味其功能的特異性。因此，我們認為PtPIP1;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8具有更大的研究價值。
　　6.通過R

7、eal-time PCR技術，得到如下相對表達量排序結果：84K楊和毛白楊的木質部薄壁細胞質膜內在蛋白基因（PtPIPs）排序分別為PIP1;3> PIP2;1> PIP2;3>PIP1;5> PIP2;4> PIP2;2> PIP1;1> PIP1;2和 PtPIP1;3> PtPIP2;3> PtPIP2;2>PtPIP2;1> PtPIP1;1> PtPIP2;7> PtPIP2;4> PtPIP1;5；84K楊的根系排序為PIP

8、1;3>PIP1;1>PIP2;2=PIP2;1>PIP2;4>PIP2;7=PIP2;8>PIP1;5=PIP1;2；84K楊葉片和葉柄排序基本一致：PIP1;3> PIP2;1> PIP2;4> PIP2;3> PIP2;2> PIP1;5> PIP1;1>PIP1;2。根據(jù)研究目的選取 PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和 PtPIP2;8進行表達載體構建。
　　7.以pBI121和pBI

9、RNAi植物表達載體為中間載體，成功構建了PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8這5個基因的13個植物表達載體（5個超表達植物表達載體、4個RNAi抑制植物表達載體和4個特異啟動子植物表達載體）。
　　8.獲得PtPIP1;1、PtPIP2;3和PtPIP2;83個基因的異源超表達轉基因擬南芥。與野生型擬南芥相比，轉PtPIP1;1基因的擬南芥生長發(fā)育加快，氣孔密度增大；葉片相對含