Cytophaga hutchinsoni纖維素酶系研究.pdf

1、Cytophaga hutchinsonii是廣泛分布于土壤中屬擬桿菌門的革蘭氏陰性細菌，具有很強的纖維素降解能力，在貧瘠條件下可以快速徹底地降解結晶纖維素。C.hutchinsonii沒有游離的纖維素酶產生，其纖維素酶都是細胞結合型的，而且在纖維素降解過程中也沒有胞外還原糖的積累。基因組序列分析顯示C.hutchinsonii也不含編碼錨定蛋白或粘附蛋白的基因，而這兩者是纖維小體的重要組成。因此，C.hutchinsonii對纖維素的

2、降解既不采取好氧真菌的游離纖維素酶機制也不采取厭氧細菌的纖維小體機制，可能采用一種新型并且未知的纖維素降解機制。對這種纖維素降解機制的研究可能會對實現纖維素的生物轉化有一定幫助。而目前為止對C.hutchinsonii的纖維素降解機制了解甚少，其纖維素降解酶大部分也是未知的。通過基因組分析知道C.hutchinsonii中不含編碼已知纖維素外切酶的基因，其纖維素酶編碼基因中也不含碳水化合物結構域(cabohydratebinding m

3、odule，CBM)。因而對C.hutchinsonii纖維素酶的研究顯得尤為重要，不僅可以幫助了解這種新型的纖維素降解機制，還有可能幫助發(fā)現一些新型的纖維素酶，擴大工業(yè)用纖維素酶的來源。
　　本文將C.hutchinsonii中預測的多個纖維素酶在Escherichia.coli中進行了表達，對得到活性表達的蛋白進行了性質研究，發(fā)現三個新型的纖維素酶。具體研究內容以及取得的結果如下:
　　1.持續(xù)性內切纖維素酶CHU210

4、3的研究
　　持續(xù)性纖維素酶一般包括外切纖維素酶和持續(xù)性內切纖維素酶，可以持續(xù)降解纖維素鏈產生纖維二糖或纖維寡糖，在結晶纖維素降解過程中起重要作用。C.hutchinsonii基因組分析發(fā)現不含編碼已知外切纖維素酶的基因，但有兩個內切纖維素酶（CHU_1107和CHU_2103）與已知的持續(xù)性內切纖維素酶相似性比較高，其中CHU_2103由346個氨基酸殘基組成，含有一個糖苷水解酶家族5(Glycoside hydrolase，G

5、H5)的保守結構域，而且與其他GH5家族持續(xù)性內切纖維素酶不同，CHU_2103不含有CBM。
　　在E.coli中表達CHU_2103，得到有活性的蛋白，對其性質研究當發(fā)現，CHU_2103不僅可以降解羧甲基纖維素(CMC)，還可以降解對硝基苯纖維二糖苷(pNPC)和纖維三糖，而pNPC和纖維三糖一般是外切纖維素酶的底物，不能被內切纖維素酶降解，說明CHU_2103兼具內切纖維素酶和外切纖維素酶活性。CHU_2103降解不溶性纖

6、維素的最終產物是纖維二糖和纖維三糖，并且產生的還原端中約80％來自于可溶性組分，顯示CHU_2103可以持續(xù)降解纖維素鏈產生更多的可溶性還原糖。在降解CMC過程中，CHU_2103可以在短時間內大幅降低CMC溶液的黏度，并且反應的最終產物是一系列聚合度不同的纖維寡糖，說明以內切方式降解CMC，結合對不溶性纖維素的降解方式，判斷CHU_2103是持續(xù)性內切纖維素酶。CHU_2103降解纖維寡糖時終產物中葡萄糖的含量極少，而且在降解pNP-

7、纖維寡糖過程中有更大聚合度的纖維寡糖產生，說明CHU_2103不僅具水解酶活性，也具有轉糖基酶活性，可以通過轉糖基作用生成更長鏈的寡糖。
　　與已報道的持續(xù)性纖維素酶不同，CHU_2103只含有一個催化結構域(CD)，不含碳水化合物結合結構域(CBM)，而且CHU_2103可以吸附纖維素，說明其纖維素吸附能力存在于催化結構域。對其催化結構域活性位點附近保守氨基酸定點突變，發(fā)現197位色氨酸是CHU_2103保持持續(xù)性降解和纖維素吸

8、附能力的關鍵位點，將W197突變?yōu)楸彼岷驝HU_2103不能吸附纖維素也失去了持續(xù)降解的能力，變?yōu)榈湫偷膬惹欣w維素酶。
　　在C.hutchinsonii中通過同源雙交換將chu_2103基因敲除后，其在纖維素為唯一碳源培養(yǎng)基上的生長幾乎不受影響，而對其細胞表面和細胞裂解液內切纖維素酶活檢測發(fā)現chu_2103敲除株的活性分別降低35％和25％，說明CHU_2103是C.hutchinsonii細胞表面重要的內切纖維素酶但并不是

9、其降解纖維素過程中關鍵或必需的纖維素酶。
　　2.Ca2+依賴的持續(xù)性內切纖維素酶CHU_1280的研究
　　CHU_1280由571個氨基酸殘基組成，含有一個GH9家族保守結構域，不含CBM，與Clostridium.thermocellum中一個外切纖維素酶具有較高的相似性，其序列一致性可達29％。CHU_1280的三維結構與C.thermocellum中CelD相似性極大，并含有兩個保守的Ca2+結合位點。在E.col

10、i中表達CHU_1280并得到大量有活性的蛋白，對其性質研究發(fā)現CHU_1280在不含Ca2+體系中不表現出任何活性，而在反應體系中加入一定濃度CaCl2后既可以降解CMC也可以降解pNPC，說明其活性是Ca2+依賴的。
　　CHU_1280降解CMC過程中可以迅速降低CMC溶液的黏度，最終產物為一系列聚合度不同的纖維寡糖，而降解不溶性纖維素的最終產物為葡萄糖和纖維二糖，并且產生的還原端中近80％來自于可溶性組分，說明CHU_12

11、80以內切方式降解CMC并且可以持續(xù)降解不溶性纖維素，屬于持續(xù)性內切纖維素酶。
　　CHU_1280對纖維三糖、纖維四糖以及纖維五糖等纖維寡糖也具有降解能力，降解纖維三糖的主要產物是葡萄糖和纖維二糖，降解纖維四糖的主要產物是纖維二糖還有少量的葡萄糖和纖維三糖，降解纖維五糖的主要產物是纖維二糖和纖維三糖還有少量葡糖糖和纖維四糖，說明CHU_1280更傾向于降解糖鏈內部的糖苷鍵，也可以從非還原端切下少量的葡萄糖。
　　CHU_1

12、280中不舍CBM，但發(fā)現其可以吸附纖維素，而且對纖維素的吸附性也是Ca2+依賴，說明Ca2+可以改變CHU_1280的結構，使其具有吸附并且降解纖維素的能力。
　　一般認為現Ca2+促進纖維素酶活力是通過增強酶的穩(wěn)定性使其活力增大，但通過對CHU_1280穩(wěn)定性檢測發(fā)現，以酶活性作為表征時，Ca2+可以使CHU_1280的耐熱性提高10℃左右(處理時間為1 h)，而以蛋白微熱量變化為表征時，則發(fā)現Ca2+使其整體蛋白結構趨于不穩(wěn)

13、定。說明Ca2+可以穩(wěn)定CHU_1280活性中心的結構而使其整體結構更加不穩(wěn)定。
　　3.纖維寡糖酶CHU_2268的研究CHU_2268由758個氨基酸殘基組成，含有一個GH3保守結構域，NCBI中注釋為GH3家族的β-葡萄糖苷酶。CHU_2268的三維結構與來自大麥的外切水解酶ExoⅠ和來自南極菌Psedoalteromonas的外切β-1，3/1，4-葡聚糖酶Exo P相似度比較高，相似性都在30％以上。SignalP預測C

14、HU2268不含信號肽序列但將其在E.coli中進行表達時發(fā)現前26個氨基酸殘基為疏水區(qū)域，可能為其信號肽序列。
　　在E.coli中表達得到活性蛋白并進行性質研究，發(fā)現CHU_2268不僅可以降解對硝基苯葡萄糖苷(pNPG)還可以降解pNPC，最終產物都是對硝基苯酚(pNP)和葡萄糖。在CHU_2268降解pNPC時，中間產物為pNPG和葡萄糖，說明CHU_2268以外切方式從非還原端逐個切下葡萄糖。
　　CHU_2268

15、還可以降解纖維二糖和纖維寡糖等，最終產物都是葡萄糖，而且對各種寡糖底物的Km值相近，說明其最適底物為纖維二糖和纖維寡糖，為纖維寡糖酶。對CHU_2268降解纖維寡糖中間產物檢測，發(fā)現其對纖維寡糖的降解也是逐個切下葡萄糖，為外切方式。并且發(fā)現降解過程中有較長鏈的寡糖產生，說明CHU_2268為具有轉糖基活性的纖維寡糖酶。
　　CHU_2268可以與內切纖維素酶協同降解纖維素產生葡萄糖，并且與內切纖維素酶的協同作用遠大于β-葡萄糖苷酶

16、與內切纖維素酶的協同作用，可能在C.hutchinsonii纖維素降解過程中起重要作用。
　　4.利用Blue-native PAGE探究C.hutchinsonii膜上的蛋白復合體
　　C.hutchinsonii細胞膜上具有不同種類的纖維素酶，但這些纖維素酶各自單獨起作用還是以復合體形式共同作用于纖維素目前還不清楚，對C.hutchinsonii膜上與纖維素酶相互作用蛋白的研究或許可以幫助回答這個問題。
　　Blu

17、e-native PAGE(BN-PAGE)是最初是為研究線粒體膜蛋白和蛋白復合體而建立的一種非變性電泳方法，這種方法在分離蛋白復合體的時候可以保持其生物學活性，可以用于蛋白與蛋白間相互作用以及膠內活性檢測等方面的研究。將BN-PAGE與SDS-PAGE、活性染色以及蛋白質譜鑒定結合，對膜上的三個蛋白復合體進行了初步鑒定，它們可能分別與葡萄糖代謝以及寡肽的運輸利用相關。而且發(fā)現C.hutchinsonii膜上有三個β-葡萄糖苷酶活性條帶

18、，其中一個β-葡萄糖苷酶可能以復合體形式存在，SDS-PAGE發(fā)現里面含有六種不同的蛋白，這些蛋白有待于進一步的質譜鑒定和研究。
　　通過以上研究，對C.hutchinsonii的纖維素酶系有了較為深入地了解。研究發(fā)現C.hutchinsonii不依賴外切纖維素酶，而是通過內切纖維素酶、持續(xù)性內切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和纖維寡糖酶的協同作用完成對纖維素的降解。對C.hutchinsonii的纖維素酶系的研究為揭示其獨特的纖維素降