內(nèi)源性硫化氫在脂多糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制探討.pdf

1、目的：探討脂多糖（LPS）誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞CBS-H2S、CSE-H2S體系的規(guī)律性變化；查明CBS、CSE分別及聯(lián)合來(lái)源的H2S在LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用，探討內(nèi)源性H2S調(diào)節(jié)作用相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞培養(yǎng)，用CBS siRNA、CSE siRNA或CBS、CSE選擇性抑制劑 AOAA、PAG單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于正常培養(yǎng)的 BRL細(xì)胞、LPS處理的BRL細(xì)胞。用RT-PCR、Western blot和

2、免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)CBS、CSE的基因和蛋白表達(dá)變化、蛋白定位，用去蛋白法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成量變化；生化方法檢測(cè)細(xì)胞上清LDH活性、細(xì)胞MDA含量、細(xì)胞GSH含量以及MTT細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率變化；用流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化；熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位（MMP）變化；Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素C（Cyt C）、caspase-3激活體蛋白表達(dá)變化。分別用CBS、CSE選擇性抑制劑

3、AOAA、PAG和PKCε、P44/42、STAT3特異性抑制劑（SCP0213、A6355、S31-201）交互作用的方法處理 LPS誘導(dǎo)BRL細(xì)胞凋亡，提取細(xì)胞不同組分蛋白質(zhì)如細(xì)胞總蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，用Western blot檢測(cè)LPS誘導(dǎo)BRL細(xì)胞凋亡過(guò)程中信號(hào)分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化修飾、PKCε活化后膜移位、STAT3活化后核移位。
　　結(jié)果：1、大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞在靜息條件下存在著

4、CBS和CSE基因、蛋白表達(dá)以及內(nèi)源性H2S生成，CBS、CSE蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿；CBS siRNA、CSE siRNA分別引起B(yǎng)RL細(xì)胞CBS、CSE蛋白表達(dá)下調(diào)，內(nèi)源性H2S生成明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯增高，其中，相對(duì)于CBS siRNA引起B(yǎng)RL細(xì)胞H2S生成減少，CSE siRNA引起B(yǎng)RL細(xì)胞H2S生成減少更明顯，CBS siRNA、CSE siRNA聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步引起內(nèi)源性H2S降低；與Negative contr

5、ol組比較，CBS siRNA、CSE siRNA單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染 BRL細(xì)胞4-24h，BRL細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而且凋亡率隨時(shí)間變化而明顯增加（P﹤0.05）。其中，CBS siRNA轉(zhuǎn)染后，BRL細(xì)胞在4h、8h、12h、24h細(xì)胞凋亡率分別為12.80％、24.23%、27.67%和31.73%；CSE siRNA轉(zhuǎn)讓后，BRL細(xì)胞凋亡率在4-24h分別為17.27%、26.30%、32.33%和37.00%；當(dāng)聯(lián)合轉(zhuǎn)染CBS siRN

6、A與CSE siRNA后，BRL細(xì)胞凋亡率在4-24h分別為21.06%、30.40%、36.20%和42.40%。CBS siRNA、CSE siRNA分別或聯(lián)合作用對(duì)BRL細(xì)胞上清LDH活性、細(xì)胞MDA含量、細(xì)胞GSH含量及MTT細(xì)胞增殖活力均無(wú)明顯影響。2、CBS、CSE選擇性抑制劑AOAA、PAG單獨(dú)或聯(lián)合作用BRL細(xì)胞，內(nèi)源性H2S生成減少，細(xì)胞凋亡率上升， MMP明顯降低，胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)上調(diào)

7、，其中，PAG引起內(nèi)源性 H2S生成比 AOAA作用時(shí)生成量更少，細(xì)胞凋亡率明顯上升，MMP下降，胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)上調(diào)；AOAA、PAG可引起B(yǎng)RL細(xì)胞上清LDH活性增高，而細(xì)胞MDA含量、細(xì)胞GSH含量及MTT細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯影響。3、LPS作用BRL細(xì)胞，隨LPS作用時(shí)間延長(zhǎng)（0~24h）及LPS作用濃度（0.1~100μg/ml）升高，CBS和CSE基因、蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，內(nèi)源性H2S生成呈時(shí)間

8、依賴性和劑量依賴性明顯增多；細(xì)胞凋亡率上升，細(xì)胞MMP降低，胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)上調(diào)；BRL細(xì)胞上清LDH活性增加，細(xì)胞MDA含量上升，細(xì)胞GSH含量在8h上調(diào)，12h、24h下降，MTT細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在8h下調(diào)，12h、24h上升。4、CBS siRNA、CSE siRNA或AOAA、PAG單獨(dú)或聯(lián)合與LPS共同作用BRL細(xì)胞，與LPS單獨(dú)作用組相比，BRL細(xì)胞凋亡率在4h上升，8h無(wú)顯著性差異，12h、2

9、4h明顯下降；細(xì)胞MMP在4h下降，8h無(wú)顯著性差異，12h、24h明顯上升；胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)在4h上升，8h無(wú)顯著性差異，12h、24h明顯下降。5、LPS作用BRL細(xì)胞，信號(hào)分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化蛋白表達(dá)上調(diào)，30min顯著高于溶劑處理；其中，PKCε發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，STAT3發(fā)生核轉(zhuǎn)位；AOAA、PAG單獨(dú)或聯(lián)合與 LPS共同作用 BRL細(xì)胞，與 LPS單獨(dú)作用組相比，PKCε、P

10、44/42、STAT3磷酸化蛋白表達(dá)（進(jìn)一步明顯）上調(diào)；與LPS單獨(dú)作用組相比，PKCε、P44/42、STAT3特異性抑制劑（SCP0213、A6355、S31-201）分別與LPS共同作用BRL細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率在4h、12h時(shí)間點(diǎn)明顯上升；與CBS、CSE選擇性抑制劑AOAA、PAG+LPS作用組相比，PKCε、P44/42、STAT3抑制劑（SCP0213、A6355、S31-201）與CBS、CSE選擇性抑制劑AOAA、PAG和

11、LPS共同作用BRL細(xì)胞，4h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率未見明顯變化，12h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率明顯上升；與LPS單獨(dú)作用組相比，PKCε抑制劑（SCP0213）作用BRL細(xì)胞，P44/42、STAT3磷酸化蛋白表達(dá)下調(diào)；與LPS單獨(dú)作用組相比，P44/42抑制劑（A6355）作用BRL細(xì)胞，PKCε磷酸化蛋白表達(dá)未見明顯變化，STAT3磷酸化蛋白表達(dá)下調(diào)；與LPS作用組相比，STAT3抑制劑（S31-201）作用BRL細(xì)胞，PKCε、P44/42磷

12、酸化蛋白表達(dá)均未見明顯變化。
　　結(jié)論：1、大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞在靜息條件下存在著CBS和CSE基因、蛋白表達(dá)以及內(nèi)源性H2S生成，其中CBS來(lái)源的H2S略少于CSE來(lái)源H2S；抑制內(nèi)源性H2S生成可引起正常培養(yǎng)的BRL細(xì)胞凋亡；內(nèi)源性H2S對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用，少量生成增多H2S抑制細(xì)胞凋亡、多量生成的H2S促進(jìn)細(xì)胞凋亡；2、細(xì)胞凋亡的線粒體途徑參與介導(dǎo)了內(nèi)源性 H2S對(duì)肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)效應(yīng)；信號(hào)分子PKCε、E