DNA和蛋白質生物標志物光學分析新方法.pdf

1、生物大分子是構成生命的基礎物質，主要包括蛋白質、核酸、脂質和糖四大類，其中蛋白質和核酸是生命科學中最重要的兩類生物大分子。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是一種常見且可穩(wěn)定遺傳的基因變異，能夠誘導產生許多遺傳疾病，而人體內各種蛋白質含量的變化直接反映了人體的新陳代謝情況，這些已成為疾病診斷的主要依據。因此，針對生物體內的標志性生物大分子蛋白質和核酸的檢測、分析在生命科學和生物醫(yī)學研究以及疾病的臨床診斷領域具有十分重要的科學意義。許多的早期診斷

2、都是基于熒光光譜、熒光各向異性、熒光共振能量轉移以及表面等離子共振等的測量實現的。盡管以上這些技術非常重要，發(fā)展高特異性、高靈敏度且穩(wěn)健、易操作、低成本的蛋白質和核酸分析方法與技術一直是分析化學研究的重要內容，是分析科學家們不懈追求的奮斗目標?；诠庾V或者發(fā)光的檢測技術由于具有靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、所需儀器簡單以及易于實現微型化等特點，使得以光化學檢測為基礎的生物分析技術具有極其廣闊的應用前景。為此，本研究論文我們發(fā)展了幾種基

3、于光化學的基因分型技術、DNA檢測技術以及蛋白質分析方法：
　　 (1)建立了一種基于連接酶介導鏈置換放大一脫氧核酶催化均相免標記化學發(fā)光的基因分型新方法。該方法利用連接酶對錯配的高特異性識別，僅將與目標基因完全互補的探針共價連接。在具有強鏈置換能力的聚合酶及切刻酶的共同作用下，該連接產物3’端的發(fā)夾結構自發(fā)啟動聚合酶延伸反應，在近5’端獲得完整的切刻酶識別位點，從而介導切刻酶切割、聚合酶延伸以及鏈置換釋放的恒溫鏈置換放大反應。

4、被釋放的第一級放大產物會與另一鏈置換放大反應模板雜交，引發(fā)第二級鏈置換放大反應，釋放大量的血紅素適配體。該適配體與血紅素結合后，催化魯米諾－雙氧水反應而產生化學發(fā)光信號。據此判定目標基因與探針是否在多態(tài)性位點發(fā)生錯配，從而可實現目標基因的基因型的鑒定。該方法采用具有很好的特異性，很高的靈敏度，使其檢測限可達0.1 fM，可直接應用與基因組的檢測。同時還具有很高的信背比(150倍)與較寬的動態(tài)響應范圍(1 fM至1 nM)。而且，該方法可

5、完全在均相中實現，操作簡便，易于自動化與高通量化，因此可望在基因組研究與分子診斷領域方面具有一定的應用前景。
　　 (2)發(fā)展了一種基于高溫連接酶檢測反應介導的鏈置換放大--脫氧核酶催化化學發(fā)光的免標記基因分型新方法用于細胞色素C P4502D6*10的基因分型。該方法針利用高溫連接酶對錯配的高特異性識別，在進行退火連接－變性解鏈的熱循環(huán)過程中，僅將3’端與目標基因完全互補的探針對共價連接，產生大量的連接產物。在具有強鏈置換能力

6、的聚合酶及切刻酶的共同作用下，具有發(fā)夾結構的連接產物的3’端自發(fā)延伸，介導切刻酶切割、聚合酶延伸以及恒溫鏈置換反應，進行第二步擴增，釋放大量的血紅素適配體。該適配體與血紅素結合形成具有辣根過氧化酶催化活性的復合物，催化魯米諾－雙氧水反應產生化學發(fā)光信號，從而實現對目標基因的基因型的鑒定。該方法采用具有高忠實性的高溫DNA連接酶進行等位基因的判別，保證了分型方法的高特異性。同時，由于引入了線性恒溫鏈置換反應，進一步提高了方法的靈敏度，使其

7、檢測限可達0.1 pM。由于結合血紅素適配體的催化化學發(fā)光進行信號轉換，該法獲得了57倍的較高信背比，同時具有1 pM至1 nM的較寬動態(tài)響應范圍。由于該方法可完全在均相中實現，重現性好，同時無需標記，成本低廉，又操作簡便，易于自動化與高通量化，因此可望在藥理基因組研究與分子診斷領域方面具有一定的應用前景。
　　 (3)提出了一種基于連接酶鏈反應的通用PCR－生物編碼色譜多位點同時檢測的基因分型新方法。該方法針對目標DNA設計了

8、一對等位特異性區(qū)分探針和一條通用探針，具有高特異性識別能力的連接酶僅將與目標DNA完全互補的探針對共價連接。以此連接產物為擴增模版，加入熒光標記的通用引物進行PCR擴增，從而獲得大量熒光標記的含有生物編碼序列和完整限制性內切酶識別序列的擴增產物。經過限制性內切酶處理，將目標DNA的基因型鏈轉化為預先設計的生物編碼序列，再采用離子對反相高效液相色譜進行分離與同時檢測。該技術顯著地提高了目標DNA分子的檢測靈敏度和準確性。已采用該新方法對兩

9、個位點的不同基因突變情況成功地進行了同時基因分型，檢測下限為0.1 fM。
　　 (4)設計了一種基于循環(huán)酶切原理的光化學生物傳感技術用于靶核酸的簡單，靈敏與快速的分析與檢測。該方法設計了一條3’端修飾有熒光基團和淬滅基團的雙標探針。若靶核酸存在，該探針與其雜交形成完全匹配的雙鏈，從而啟動核酸外切酶Ⅲ介導的循環(huán)酶切過程，水解掉雙鏈雜交體中的雙標探針，促使熒光基團與淬滅基團分離，產生熒光信號，而未被水解的靶核酸繼續(xù)參與下一個酶切循

10、環(huán)，進而實現對靶核酸的循環(huán)放大檢測。模擬靶序列實驗證明，該方法還具有一定的堿基錯配的區(qū)分能力。在50 pM－750 pM靶核酸濃度范圍內，該方法具有較好的動態(tài)響應，檢測下限為0.1 pM。
　　 (5)構建了一種基于巢式PCR－生物編碼色譜的品系特異性轉基因玉米多靶標同時檢測新方法。該方法針對目標DNA設計了一對目標特異性探針，在目標基因存在的情況下，經第一階段幾個擴增循環(huán)產生少量PCR擴增產物；以第一階段的PCR產物為擴增模板

11、，加入熒光標記的通用引物進行第二階段的通用PCR擴增，從而獲得大量熒光標記的含有生物編碼序列和完整限制性內切酶識別序列的擴增產物。經過限制性內切酶處理，將目標DNA的基因型鏈轉化為預先設計的生物編碼序列，再采用離子對反相高效液相色譜進行分離與同時檢測。該技術顯著地提高了目標DNA分子的檢測靈敏度和準確性。已采用該新方法對四個模擬靶標序列成功地進行了同時檢測分析，檢測下限為0.01 fM。
　　 (6)開發(fā)了一種基于熒光保護分析原

12、理的均相適配體傳感技術用于蛋白的分析檢測。該技術利用熒光素標記的適配體與其受體蛋白結合，抑制熒光素抗體誘導的熒光淬滅，從而實現對受體蛋白的定量檢測。以免疫球蛋白IgE為模型蛋白的驗證實驗證明該方法具有較高的靈敏度；血清中共存蛋白的干擾實驗，證明該方法也具有很好的抗干擾能力，即具有很高的特異性。采用不同的熒光標記基團以及相應的抗體，還可以利用該方法對多蛋白進行同時分析，實現高通量檢測的目標。在0.1－50 nM濃度范圍內，該適配體傳感器具