胞質(zhì)鈣離子穩(wěn)態(tài)在酵母鋁誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的調(diào)控作用.pdf

1、鋁(Al)毒是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素之一，近年來(lái)，在脅迫植物生理學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)Al毒和耐Al的分子機(jī)制研究取得重大進(jìn)展。植物在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了兩種重要的抗Al毒機(jī)制，分別是Al的外部排斥和內(nèi)部耐受。其中，程序性細(xì)胞死亡(PCD)的負(fù)調(diào)控也是一種Al的內(nèi)部耐受機(jī)制。Al3+在誘導(dǎo)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)凋亡發(fā)生時(shí)，伴隨著胞質(zhì)鈣離子(Ca2+)水平的上升，而在酵母中過(guò)量表達(dá)凋亡抑制因子時(shí)，胞

2、質(zhì)Ca2+水平下降。但是胞質(zhì)Ca信號(hào)在PCD中的調(diào)控作用及其抗Al毒的內(nèi)部耐受機(jī)制仍不清楚。本論文研究了釀酒酵母液泡Ca2+泵Ca2+-ATPase Pmc1p、細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM和凋亡抑制因子調(diào)控胞質(zhì)Ca2+水平的功能以及胞質(zhì)Ca2+濃度及其穩(wěn)態(tài)在Al3+誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡中的調(diào)控作用。取得主要結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)測(cè)定一系列酵母Ca2+通道突變體的Al毒敏感性，發(fā)現(xiàn)與野生型和其它Ca2+通道突變體相比，液

3、泡Ca2+-ATPase PMC1的突變體(pmc1)對(duì)Al毒更加敏感。
　　 2.在Al3+處理?xiàng)l件下，野生型和pmc1突變體菌株都發(fā)生了細(xì)胞凋亡，而且pmc1突變體發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目顯著多于野生型，說(shuō)明pmc1突變體由于液泡Ca2+通道異常，失去利用液泡調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca2+水平的功能，引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加，促進(jìn)PCD發(fā)生。暗示胞質(zhì)Ca信號(hào)上升是Al3+誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生PCD的一個(gè)早期事件。
　　 3.為了分析pmc1

4、突變體對(duì)Al毒敏感是否具有特異性，進(jìn)一步用可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡的其它脅迫因子山梨醇、銅離子(Cu2+)和鎘離子(Cd2+)作實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明pmc1突變體只對(duì)Ca和Al脅迫敏感。
　　 4.野生型和pmc1突變體細(xì)胞在不同pH值的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)能力相似，pH的變化幾乎沒(méi)有改變胞質(zhì)Ca2+水平。而在Al處理?xiàng)l件下，pmc1突變體比野生型對(duì)Al毒更加敏感。說(shuō)明pmc1突變體和野生型酵母在Al脅迫下產(chǎn)生的差異是由Al毒引起的而不是由于

5、加入Al3+降低培養(yǎng)基pH值所引起的。
　　 5.為了研究PMC1能否緩解pmc1突變體對(duì)Al毒的敏感性，構(gòu)建了PMC1的表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)到野生型和pmc1突變體菌株中。結(jié)果表明，在Ca、Al脅迫處理下，過(guò)量表達(dá)PMC1的菌株胞質(zhì)Ca2+水平降低，從而增強(qiáng)了對(duì)Ca和Al脅迫的耐受性。
　　 6.胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM的實(shí)驗(yàn)表明，在1mM Al3+處理酵母細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)Ca2+水平隨加入BAPTA-AM濃度的增加

6、而呈下降的趨勢(shì)，并且BAPTA-AM的加入使酵母細(xì)胞存活率上升。說(shuō)明BAPTA-AM可以抑制胞質(zhì)過(guò)多的游離Ca2+，緩解Al對(duì)酵母的毒害作用。證實(shí)了Al3+誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡是通過(guò)胞內(nèi)Ca信號(hào)波動(dòng)和Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)控的。抑制Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+的上升可以降低Al對(duì)細(xì)胞的毒害作用。
　　 7.為了研究凋亡抑制因子能否緩解pmc1突變體對(duì)Al毒的敏感性，將凋亡抑制基因(Bcl-2、Ced-9或PpBI-1)轉(zhuǎn)入野生型和pmc1突變體

7、菌株中。結(jié)果表明，在Al3+處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞中Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+上升的水平明顯低于對(duì)照細(xì)胞，表達(dá)Bcl-2、Ced-9或PpBI-1的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞對(duì)Al脅迫的耐受性提高，說(shuō)明Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+水平上升可以被抗凋亡蛋白所抑制，凋亡抑制因子能夠部分彌補(bǔ)Ca2+-ATPase PMC1的功能。因此，可以通過(guò)對(duì)PCD的負(fù)調(diào)控調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而緩解Al對(duì)細(xì)胞的毒害作用。
　　 8.為了研究Ca信號(hào)的分子機(jī)制