基于效應(yīng)標(biāo)志物質(zhì)譜定量技術(shù)的有機(jī)磷毒物中毒與重活化特點(diǎn)研究.pdf

1、有機(jī)磷毒物屬于一類(lèi)含磷有機(jī)物，有機(jī)磷毒物依效能可分為神經(jīng)性毒劑（Nerve agents,NAs）和有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphoruspesticides）。急性有機(jī)磷中毒的救治策略主要是利用阿托品進(jìn)行對(duì)癥治療以及利用肟類(lèi)化合物進(jìn)行對(duì)因治療。而阿托品僅作用于毒蕈堿型受體，救治效果不佳，增大用藥劑量又會(huì)引起阿托品中毒；因此肟類(lèi)化合物作為一種特異性解毒藥被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于急性有機(jī)磷中毒的救治。但肟類(lèi)重活化劑無(wú)法進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，

2、且目前對(duì)其重活化效果存在一定爭(zhēng)議：一種觀點(diǎn)認(rèn)為肟類(lèi)化合物通過(guò)重活化神經(jīng)或肌肉組織內(nèi)中毒乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase,AChE），從而恢復(fù)酶活性以及受損的身體機(jī)能；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為肟類(lèi)化合物在重活化過(guò)程中可與游離毒劑或與離去的磷酸（或膦酸）基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成一種膦?；恐虚g體，該中間體帶有季銨正電荷，更易攻擊帶有負(fù)電荷的酶活中心，故具有更強(qiáng)抑酶毒性，或許是造成肟類(lèi)藥物重活化效果不佳甚至出現(xiàn)加深中毒現(xiàn)象的原因。

3、>　　目前對(duì)有機(jī)磷毒物中毒救治的研究工作多基于經(jīng)典的Ellman法等酶活測(cè)定法開(kāi)展，然而Ellman法作為酶活測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)，依然存在一定的局限性，例如，AChE的測(cè)定易受丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase,BChE）干擾，準(zhǔn)確度低；靈敏度低，當(dāng)中毒濃度低于20％時(shí)，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定；同時(shí)測(cè)定酶活時(shí)，體系中其他膽堿酯酶抑制劑或重活化劑等藥物的存在會(huì)造成一定干擾，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；更為重要的是該方法特異性較差，無(wú)法分

4、辨中毒類(lèi)型，同時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確描述AChE所處的狀態(tài)（活性態(tài)、中毒態(tài)、老化態(tài)）。本課題研究建立了一種液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）定量測(cè)定方法用于研究神經(jīng)性毒劑中毒特點(diǎn)與救治，該方法通過(guò)對(duì)毒物特異性加合肽段進(jìn)行定量檢測(cè)，提供效應(yīng)酶中毒程度的數(shù)據(jù)，同時(shí)能夠定量獲取效應(yīng)酶中毒后所處的不同狀態(tài)，尤其是對(duì)于低劑量有機(jī)磷毒物暴露時(shí)，經(jīng)典Ellman

5、法無(wú)法準(zhǔn)確獲得酶活性抑制率，而該方法對(duì)于抑制率小于1%的情況亦可進(jìn)行準(zhǔn)確分析。
　　本課題研究中，針對(duì)有機(jī)磷毒物中毒救治難題以及現(xiàn)有方法存在的諸多弊端，展開(kāi)深入研究。本研究論文共分為四章：
　　第一章：前言，對(duì)有機(jī)磷毒物及其中毒機(jī)理、中毒救治研究方法、抗毒藥物概況進(jìn)行了介紹，并提出本論文的研究意義與目的。
　　第二章：有機(jī)磷農(nóng)藥與AChE連接的基團(tuán)多為二甲氧基膦?；鶊F(tuán)（Dimethylphosphoryl,DMP）以及

6、二乙氧基膦?；鶊F(tuán)（Diethylphosphoryl,DEP），本章針對(duì)這兩類(lèi)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)制備了二甲基膦酰化十一肽和二乙基膦?；浑模诖嘶A(chǔ)上利用課題組前期研究建立針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒救治研究的LC-MS/MS定量測(cè)定方法，對(duì)常見(jiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏、敵百蟲(chóng)、久效磷、對(duì)氧磷的中毒特點(diǎn)及重活化特點(diǎn)進(jìn)行考察，有機(jī)磷農(nóng)藥的中毒過(guò)程相對(duì)神經(jīng)性毒劑較為緩慢，四種有機(jī)磷農(nóng)藥的中毒速率由快至慢依次為對(duì)氧磷、敵百蟲(chóng)、敵敵畏、久效磷。對(duì)于同一種有機(jī)磷農(nóng)藥，不同

7、重活化劑表現(xiàn)出不同的重活化效果：對(duì)于敵敵畏，雙復(fù)磷（Obidoxime,L-1656）的重活化效果更佳；對(duì)于敵百蟲(chóng)，酰胺磷定（Asoxime,HI-6）的重活化效果更佳；對(duì)于久效磷，氯解磷定（Pralidoxime chloride,2-PAM）表現(xiàn)出顯著的重活化效果優(yōu)勢(shì)；對(duì)于對(duì)氧磷，三種重活化劑皆呈現(xiàn)良好的重活化效果，各重活化劑的抗毒效果呈現(xiàn)顯著差異，缺乏有效且廣譜的抗毒藥物；且通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，二乙氧基膦酰化中毒酶較二甲氧基膦?；卸久?/p>

8、更易被重活化劑重活化。該評(píng)價(jià)工作對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的合理使用、有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的救治具有重要參考意義。
　　第三章：針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥救治效果不佳的原因，推測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥與重活化劑形成的膦?；浚≒hosphoryl oxime,POX）是重活化效果的重要影響因素。為驗(yàn)證推測(cè)，通過(guò)對(duì)氧磷與雙復(fù)磷在巴比妥緩沖液中直接反應(yīng)成功制備得到二者的反應(yīng)產(chǎn)物—DEP-obidoxime。在體外實(shí)驗(yàn)中考察并比較對(duì)氧磷以及DEP-obidoxime對(duì)AChE的抑

9、制作用差異，利用對(duì)氧磷以及DEP-obidoxime對(duì)AChE染毒，然后基于酶解-質(zhì)譜法的分析策略，將中毒酶經(jīng)胃蛋白酶酶解后產(chǎn)生含有加合位點(diǎn)的特異肽段，利用基于效應(yīng)標(biāo)志物的質(zhì)譜定量分析技術(shù)對(duì)特異性肽段進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)氧磷以及DEP-obidoxime中毒特點(diǎn)的考察，證實(shí)DEP-obidoxime具有較強(qiáng)的AChE抑制毒性，并進(jìn)一步完成經(jīng)典重活化劑（氯解磷定、雙復(fù)磷、HI-6）抗毒效能評(píng)價(jià)工作，DEP-obidoxime膦?；腁Ch

10、E與對(duì)氧磷膦酰化的中毒酶可同樣被氯解磷定重活化，且重活化效果無(wú)顯著差異。同時(shí)半數(shù)有效濃度（Concentration for50%of maximal effect,EC50）數(shù)據(jù)表明，3種經(jīng)典重活化劑對(duì)對(duì)氧磷或DEP-obidoxime膦?；疉ChE的重活化效果由強(qiáng)至弱依次為：氯解磷定、HI-6、雙復(fù)磷。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于有機(jī)磷中毒的臨床救治用藥具有重要的參考價(jià)值。
　　第四章：針對(duì)本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)肟類(lèi)重活化劑會(huì)加深梭曼（Som

11、an,GD）中毒的現(xiàn)象，推測(cè)肟類(lèi)重活化劑作為抗毒藥物用于梭曼中毒救治過(guò)程中，可能與梭曼發(fā)生反應(yīng)，形成對(duì)AChE抑制毒性更大的膦酰化肟，成為中毒加深的根源?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本章開(kāi)展肟類(lèi)重活化劑加深梭曼中毒機(jī)制的研究。首先，采用光譜法和氣相色譜法對(duì)神經(jīng)性毒劑梭曼與重活化劑的相互作用展開(kāi)研究，研究發(fā)現(xiàn)肟類(lèi)重活化劑雙復(fù)磷、氯解磷定以及HI-6可與梭曼明顯發(fā)生反應(yīng)，而我所自主研發(fā)的叔胺類(lèi)重活化劑L-1978、L-1655不與梭曼發(fā)生反應(yīng)。隨后在第三