三種食源性致病菌多重環(huán)介導恒溫擴增檢測技術(shù)研究.pdf

1、近年來食品安全問題不斷，人們漸而不以為奇，甚或一度談“食”色變。食源性疾病是我國乃至世界范圍內(nèi)的首要食品安全問題，以及公共衛(wèi)生問題之一，給世界各國帶來了難以估量的經(jīng)濟負擔和社會影響。在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化學物理以及有毒動植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位；而細菌在微生物中占絕大多數(shù)，所以食源性致病菌是我國食品安全和公眾健康面臨的最根本問題。沙門氏菌是最常見且最重要的致病菌，其血清型眾多，是我國細菌性

2、食源性疾病中位居第二位的致病菌。副溶血性弧菌大量分布于世界各地的近海水域，人類大多由于攝入生的或未熟的海產(chǎn)品而致病，其已成為我國乃至亞洲許多國家第一位的食源性致病菌。單核細胞增生李斯特菌可引起致命性的李斯特菌病，其在歐美國家十分常見，近年來在我國市售食品中也頻頻檢出，已成為我國最常見的食源性致病菌之一。對于上述三種致病菌，建立其快速篩查和診斷的方法十分必要。
　　總的來說，食源性致病菌的快速鑒定方法包括免疫學方法、生物傳感器技術(shù)以

3、及核酸檢測。免疫學方法如ELISA、IMS等依賴于抗原抗體的特異結(jié)合，抗干擾能力差。生物傳感器技術(shù)具有低穩(wěn)定、高成本的缺點。PCR及其衍生技術(shù)作為核酸檢測的經(jīng)典代表，在檢測靈敏度、穩(wěn)定性方面都大有增進，但其對專業(yè)操作和精密儀器如溫度循環(huán)儀的依賴使其應用至今仍局限于實驗室內(nèi)，越發(fā)難以滿足傳染病即時診斷的現(xiàn)實需求。核酸恒溫擴增技術(shù)的出現(xiàn)填補了這一缺憾，這些方法無需熱循環(huán)，在恒溫條件下即可實現(xiàn)核酸序列的特異擴增，從而使核酸檢測從實驗室走向現(xiàn)場

4、成為可能。
　　LAMP技術(shù)，即環(huán)介導恒溫擴增，是核酸恒溫擴增的集大成者。其反應在恒溫條件下，僅需一種類型的酶即可實現(xiàn)擴增；擴增反應在60min內(nèi)完成，且具有高特異性和類似于巢式PCR的靈敏度；快速、連續(xù)的LAMP反應成就了其高擴增效率，還可用于RNA的擴增；其結(jié)果肉眼可判，也可利用濁度和熒光對其反應進行實時監(jiān)測。由于LAMP反應結(jié)合了以上特點，其自發(fā)明以來在各領(lǐng)域都有深入應用，包括病原鑒定、基因診斷、環(huán)境樣品的快速檢測等。

5、>　　LAMP技術(shù)的發(fā)展似乎已十分完備，但美中不足的是，目前LAMP反應大都局限于單靶標檢測，即一次反應只能檢測一個目的基因，多重LAMP的發(fā)展受到限制。究其原因，大致可歸結(jié)為一“易”一“難”：一是多重LAMP體系非特異擴增之易；由于LAMP引物為4-6條，多重LAMP體系中引物數(shù)量就要數(shù)倍于此，引物間交叉反應的幾率相應增加，從而導致非特異擴增。二是多重LAMP體系目的基因區(qū)分之難；由于LAMP產(chǎn)物大小不等、長短不一，所以多重LAMP無

6、法像多重PCR那樣僅通過電泳就可對其體系中的多個目的片段進行區(qū)分。這兩個因素是制約多重LAMP發(fā)展的瓶頸。鑒于以上分析，本研究主要有以下三部分內(nèi)容：
　　一．副溶血性弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌LAMP檢測方法的建立
　　分別以副溶血性弧菌tlh基因、沙門氏菌bcfD基因、單增李斯特菌iap基因為靶序列，設(shè)計相應的LAMP引物，Blast序列分析進一步驗證引物特異性；綜合考慮擴增效率和檢測靈敏度，選取最優(yōu)引物，建立LAMP反

7、應體系。以相近的其他食源性致病菌DNA為模板評價其特異性，以PCR反應為參照判定和評價其檢測靈敏度。實時濁度結(jié)果顯示，擴增可在40min內(nèi)完成。特異性實驗顯示，這三種致病菌的LAMP引物均只能擴增其相應的目的基因，而以其他相近致病菌DNA為模板的反應和陰性對照均無擴增出現(xiàn)，表明其高度特異。以PCR反應作為比較的靈敏度實驗顯示，該法靈敏度好，或具有優(yōu)于PCR的靈敏度。
　　二．副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重LAMP檢測方法

8、的建立
　　本實驗旨在建立能夠同時檢測副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的多重LAMP反應體系。引入引物濃度優(yōu)化的概念和意識，通過考察三種引物濃度組合的多重反應體系對擴增效率的影響，綜合考慮檢測成本，以確定最佳引物配比，并以此建立多重LAMP反應體系，初步評價特異性和靈敏度。結(jié)果顯示，減少各LAMP引物濃度為其原濃度的一半（1.3μmol/L），以此建立的含有18條引物的多重LAMP反應體系，在保證擴增效率的同時，又能減小非特異

9、擴增產(chǎn)生的可能。特異性和靈敏度實驗表明，當這三種致病菌DNA或之一、或之二、或之三存在時，該多重LAMP都能夠?qū)⑵錂z測出來，其最低檢測濃度與相應的單重LAMP靈敏度是一致的。該方法在某種程度上減少了工作量、節(jié)省了成本，適用于大量樣品檢測時的初步篩查和診斷。
　　三．沙門氏菌和副溶血性弧菌多重實時熒光LAMP檢測方法的建立
　　本實驗旨在建立一種同時檢測并鑒別沙門氏菌和副溶血性弧菌的多重實時熒光LAMP方法，以打破“多重LAM

10、P體系目的基因區(qū)分之難”的瓶頸。其方法是在多重LAMP反應體系中加入熒光染料EveGreen，在反應結(jié)束后對多重LAMP產(chǎn)物進行熔解曲線分析，依據(jù)目的基因LAMP產(chǎn)物熔解溫度（Tm值）的不同以同時檢測沙門氏菌和副溶血性弧菌，并進行區(qū)分。初步評價該實時熒光LAMP的特異性和靈敏度，并研究其定量能力。
　　實驗結(jié)果顯示，沙門氏菌bcfD基因和副溶血性弧菌toxR基因LAMP產(chǎn)物具有相對穩(wěn)定的Tm值，分別為86.25±0.06℃和84.

11、05±0.06℃；這兩個Tm值之間的差異可使二者在多重體系中被區(qū)分，在熔解曲線上表現(xiàn)為兩個峰值。特異性實驗顯示，該方法能夠擴增全部的沙門氏菌和副溶血性弧菌DNA，且7株沙門氏菌的Tm值統(tǒng)一落在86.5oC-86.8oC之間；表明該方法具有較好的檢測特異性。對沙門氏菌和副溶血性弧菌同時檢測和鑒別的靈敏度與多重PCR是一致的。該實時熒光LAMP定量能力評價實驗表明，模板DNA濃度與反應時間Cq值之間存在線性關(guān)系（R2=0.934），表明該法