毛囊特異性表達VEGF164條件打靶載體的構建及轉基因細胞系的篩選與鑒定.pdf

1、哺乳動物絨毛生長調(diào)控是一個非常復雜的過程，經(jīng)歷毛囊的發(fā)育、分化和絨毛生長等過程，這一過程受到許多功能基因和生長相關因子的調(diào)控。毛囊特異性表達外源功能基因促進絨毛生長，培育高產(chǎn)絨量轉基因動物新品系是近年研究的熱點之一。同時轉基因動物的安全性問題也顯得十分重要，如何刪除用于篩選轉基因細胞克隆的標記基因是解決安全性問題的關鍵。本研究從選擇毛囊特異性啟動子和條件性刪除標記基因兩方面入手，首先克隆毛囊特異性表達的人表皮角蛋白14啟動子(Humke

2、ratin14promoter,K14p)，然后構建pK14-DsRed2-1載體驗證K14p的特異性。通過引入Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)構建毛囊特異性表達VEGF164的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL，分別穩(wěn)定轉染絨山羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞，篩選穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉基因細胞克隆，檢測VEGF164基因在不同細胞中的表達量。最后獲得毛囊特異性表達外源VEGF164及可通過Cre酶刪除標記基因的核移植細胞供體。<

3、br>　　實驗采用PCR技術克隆人表皮角蛋白14啟動子，并進行啟動子信息分析。以pDsRed2-1載體為基本骨架將K14啟動子序列亞克隆到紅色熒光蛋白表達元件DsRed上游，構建驗證毛囊特異性載體pK14-DsRed2-1。通過融合PCR法，構建含有毛囊特異性啟動子K14p和LoxP序列原件-K14p-VEGF164-K14PolyA-LoxP-CDsRed-的毛囊特異性表達VEGF164的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL。打靶

4、載體以lipofectamineTM2000介導轉染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞克隆，PCR鑒定外源基因在細胞基因組中的整合，采用SYBRGreen熒光實時定量檢測VEGF164mRNA在兩種細胞中的表達量，Westernblot檢測VEGF蛋白在兩種細胞中的表達。
　　結果表明克隆的人表皮角蛋白14(K14)啟動子，長度為2274bp，與NCBI上報道的人表皮角蛋白14啟動子序列(

5、DQ343282.1)有99.5％的相似性。核苷酸序列中GC含量為56％，TATA位點位于2169bp，序列中CpG島序列起始于2061bp終止于2265bp。構建的毛囊特異性表達VEGF164基因的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL經(jīng)測序驗證構建正確，載體元件K14啟動子，VEGF164基因，K14PolyA，CMV啟動子，Loxp和紅色熒光蛋白均按正確順序連接。pCDsRed2-K14VL轉染絨山羊胎兒成纖維細胞和皮膚成纖維細

6、胞，分別篩選得到轉基因細胞克隆，PCR檢測顯示外源載體序列整合到了細胞基因組中。RT-PCR和Westernblot檢測表明轉染VEGF164基因的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞中的VEGF164蛋白表達量和mRNA表達量與內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞相比均有明顯增加。表明外源VEGF164基因在皮膚成纖維細胞中得到特異性表達。
　　本研究正確克隆了人K14基因啟動子并通過對比表達實驗驗證其具有毛囊特異性啟動功能。成功構建條件性去除