鹽酸右美托咪定對豬冠狀動脈平滑肌BKCa通道的作用及機制研究.pdf

1、目的：鹽酸右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）是一種強效α2腎上腺素能受體(alpha-2-adrenoeeptor，α2AR)激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感、降低應(yīng)激反應(yīng)、減少麻醉藥用量，穩(wěn)定血流動力學的作用，已廣泛應(yīng)用于麻醉術(shù)前用藥、術(shù)中輔助用藥、ICU鎮(zhèn)靜。動物實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)，Dex對心肌有很好的保護作用。
　　大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(Big Calcium-activated Potassium C

2、hannels，BKCa)是血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC)膜上一種重要的鉀離子通道，是血管平滑肌上最主要的外向電流通道，激活 BKCa可導(dǎo)致血管舒張。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，臨床劑量的 Dex可以舒張豬冠狀動脈， KCa通道抑制劑 TEA（10-5mmol/L）可以明顯減弱 Dex對冠狀動脈的舒張作用,表明 BKCa與 Dex舒張冠狀動脈有關(guān)，但 Dex對冠狀動脈 BKCa是否有直接激活作

3、用未見報道。本實驗旨在利用單通道膜片鉗技術(shù)觀察 Dex對豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa及與轉(zhuǎn)染在HEK293細胞上的BKCa的影響，探討 Dex是否通過直接激活 BKCa通道而舒張冠狀動脈，進而發(fā)揮心肌保護作用。
　　方法：（1）分離豬冠狀動脈左前降支近段血管，斜行剪成小塊，經(jīng)過兩步酶消化法，將組織消化為單個冠狀動脈平滑肌細胞。將膜電位鉗制于+40mV，在內(nèi)面向外式下，細胞置于對稱性高鉀溶液([K+]0:[K+]i=140:140m

4、M)溶液中，記錄不同濃度 Dex（0,10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L）對豬冠狀動脈 BKCa的作用。（2）使用 DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）在5% CO2的培養(yǎng)箱中對表達有BKCaα亞基的HEK293細胞進行培養(yǎng)和傳代，細胞密度80%左右使用脂質(zhì)體（lipofectamine3000， Invitrogen）轉(zhuǎn)染法，將5μg的β亞基質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到3.5cm的培養(yǎng)皿中，得到穩(wěn)定表達 pCDNA3.1-BKα

5、和/或α+β的 HEK293細胞系用于進一步實驗。取細胞置于對稱性高鉀溶液([K+]0:[K+]i=140:140mM)溶液中，在+40mV去極化電壓下，使用膜片鉗技術(shù)記錄不同濃度Dex（0,10-9,10-8,10-7,10-6,10-5 mol/L）對 BKCa通道的作用。以上所得電流通過（CEZ-2300）放大，用 pCLAMP10.1軟件進行數(shù)據(jù)采集與分析，得到通道平均關(guān)閉時間（mean close Time,Tc）,平均開放時

6、間（mean open Time,To）,電流幅度值（Amplitude,Amp）和通道開放概率（Open Probability,Po）。
　　結(jié)果：1.在對稱性高鉀溶液中，豬冠狀動脈平滑肌 BKCa具有大電導(dǎo)性，電壓依賴性和 Ca2+濃度依賴性。2.豬冠狀動脈平滑肌實驗中，在對稱性高鉀溶液中， Ca2+濃度為10-7 M時，各個Dex濃度對通道To和Amp影響無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），隨著 Dex濃度的升高（10-9-10

7、-5 M），Tc逐漸縮短（P＜0.05），較低濃度（10-9-10-8 M）Dex沒有顯著增加 BKCa通道 Po（P＞0.05），Dex濃度在10-7-10-5M時通道 Po增加（P＜0.05）且呈劑量依賴性。3. Ca2+濃度為0 M時，與表達α亞基BKCa（BKCa-α）比較，表達α+β亞基 BKCa（BKCa-α+β）的 Tc，Po，To和 Amp差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；溶液中的 Ca2+濃度為10-7 M時，與 BK

8、Ca-α通道比較，BKCa-α+β通道 To增加（P＜0.05），通道 Po增加（P＜0.05），Tc和 Amp差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。4.與加藥前（對照組）比較，低濃度的 Dex（10-9-10-7 M）不會引起B(yǎng)KCa-α通道的Po增加（P＞0.05），較高濃度的Dex（10-6~10-5 M）使通道 Po逐漸增加并呈劑量依賴性，To，Tc及 Amp差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。5.與加藥前（對照組）比較，不同濃度的D

9、ex（10-8-10-5 M）引起B(yǎng)KCa-α+β通道To逐漸增加（P＜0.05），低濃度的 Dex（10-9-10-8 M）沒有引起通道 Po顯著增加（P＞0.05），較高濃度的 Dex（10-7-10-5 M）使通道 Po逐漸增加并呈劑量依賴性，Tc和 Amp差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。6.在相同Ca2+濃度（10-7 M），+40mV鉗制電壓，相同Dex濃度下，與BKCa-α通道比較，BKCa-α+β通道To和Po增加（P＜

10、0.01），而Tc和Po差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1.在內(nèi)面向外式膜片上，Dex對豬冠狀動脈平滑肌 BKCa通道有激活作用，并呈一定的濃度依賴性，可能是 Dex心肌保護作用的機制。2.BKCaβ亞基能增加 BKCa的電壓敏感性和鈣敏感性。3.在內(nèi)面向外式膜片上，Dex對HEK293細胞上表達的 BKCa-α和 BKCa-α+β有激活作用，并呈濃度相關(guān)性。4. BKCaβ亞基可明顯增強Dex對HEK293細胞BK