生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細胞凋亡的作用機制.pdf

1、本文研究了生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細胞凋亡的作用機制。本研究分為三個部分：
　　第一部分：Balb/C小鼠胰島、胰腺外分泌細胞分離、純化及功能檢測。
　　目的：Balb/c小鼠胰島的分離純化。
　　方法：采用逆行膽胰管灌注V型膠原酶的方法來消化分離Balb/C小鼠胰島，單一濃度梯度淋巴細胞分離液（10771）及倒置顯微鏡下手工篩選純化胰島，DTZ（雙硫腙）特異性染色監(jiān)測胰島產(chǎn)量及純度，臺盼藍染色計算胰島細

2、胞的活性，通過ELISA試劑盒計算胰島素刺激指數(shù)以檢測胰島功能。胰腺外分泌細胞體外功能檢測，收集上清液ELISA法測定胰蛋白酶含量。
　　結果：純化后的每只Balb/C小鼠可獲150左右個高質量的胰島，活性及純度均大于90％，葡萄糖刺激胰島素釋放試驗表明胰島功能基本正常。胰腺外分泌細胞培養(yǎng)1h，4h后取上清液胰蛋白酶含量為（5.8±1.2）ng/ml,（7.3±1.0）ng/ml。
　　結論：應用本課題組成熟的實驗方法，能夠

3、獲得高純度、高質量的胰島及胰腺外分泌細胞以滿足下一步胰島移植后續(xù)實驗的需求。
　　第二部分：Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細胞共同移植動物模型的建立。
　　目的：掌握本課題組建立Balb/C糖尿病小鼠左腎被膜下純胰島移植及與胰腺外分泌細胞共同移植動物模型的方法及探討研究胰腺外分泌細胞對移植胰島的損傷作用。
　　方法：Balb/C雄性小鼠腹腔內(nèi)注射STZ（鏈脲佐菌素）誘導成為1型糖尿病小鼠。單純

4、移植組（n=10）在每只受鼠左腎被膜下移植胰島細胞團250個，共同移植組（n=10）在每只受鼠左腎被膜上下兩極同步移植胰島細胞團250個和等體積的胰腺外分泌細胞，移植術后持續(xù)監(jiān)測小鼠尾靜脈血糖的變化，一個月后左腎切除，免疫組織化學染色法觀測抗胰島素抗體及抗胰蛋白酶抗體的表達。
　　結果：⑴胰島移植后，共同移植組較單純組血糖恢復正常時間延遲2-3天，兩組移植后的糖尿病小鼠血糖均逐步恢復正常。⑵單純及共同移植組在腎被膜下可見大量抗胰島

5、素抗體陽性顯色，證實為移植胰島。共同移植組胰島細胞團周圍可見大量的抗胰蛋白酶抗體陽性顆粒，而單純移植組未見明顯的陽性顆粒。⑶胰腺外分泌細胞和胰島細胞團共同移植后，證實胰腺外分泌細胞可釋放大量的胰蛋白酶損傷移植胰島的功能恢復。
　　結論：①選取誘導糖尿病模型的小鼠體重量大于26g,以1.75mg/kg腹腔內(nèi)注射可以誘導糖尿病模型。②成功建立了胰島和胰腺外分泌細胞共同移植的動物模型，為后續(xù)實驗提供前期動物模型準備工作。
　　第三

6、部分：生長抑素對小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細胞凋亡的作用機制。
　　目的：探討生長抑素如何減輕小鼠胰島移植過程中胰腺外分泌細胞對移植胰島的損傷及其促進胰腺外分泌細胞凋亡的作用機制。
　　方法：⑴體外實驗：隨機選取雄性BALB/C小鼠30只，獲取胰島和胰腺外分泌細胞，隨機分組及短期共同培養(yǎng)后，采用流式細胞術儀檢測凋亡、測定上清液中胰蛋白酶含量及檢測胰島的胰島素含量和刺激指數(shù)、外分泌細胞及胰島細胞涂片后采用TUNEL染色檢測細

7、胞凋亡和免疫組化測定P53蛋白。⑵體內(nèi)實驗：采用膽總管內(nèi)逆行灌注膠原酶的方法分別分離、純化胰腺外分泌細胞和胰島，分別在小鼠上下極同時移植胰島250個及與其體積胰腺外分泌細胞，成功建立40只胰島移植模型，采用隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，實驗組術后腹腔注射生長抑素10ng/g，對照組術后腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)測定血糖水平及觀察生命體征的變化。術后5天摘除小鼠左腎移植物，采用冰凍切片TUNEL染色檢測胰腺外分泌細胞凋亡，免疫組化SP技

8、術測定移植物中的胰蛋白酶釋放量。
　　結果：①流式細胞術結果顯示，胰島細胞實驗組和對照組細胞凋亡率分別為(6.76±0.30)%和（6.21±0.40)%,兩組對較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；生長抑素實驗組和對照組細胞凋亡率分別為(21.34±0.34)%和（15.76±0.40)%,兩組對較，實驗組凋亡率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②原代培養(yǎng)后上清液中胰蛋白酶的含量ELISA測定：純化胰島組上清液中

9、胰蛋白酶濃度為（0.43±1.11）ng/ml，對照組為(5.03±1.20) ng/ml，后者明顯高于前者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;實驗組上清液中胰蛋白酶濃度為（2.43±1.30）ng/ml，低于對照組，但高于純化胰島組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；③原代培養(yǎng)后胰島素刺激指數(shù)的比較：純化胰島組胰島素刺激指數(shù)為3.85±1.20，對照組為1.55±1.12，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;實驗組胰島

10、素釋放指數(shù)為2.53±1.10，低于純化胰島組，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；④胰腺外分泌細胞和胰島涂片的TUNEL結果分析：胰腺外分泌細胞凋亡指數(shù)：TUNEL結果表明，實驗組胰腺外分泌細胞凋亡指數(shù)為（25.37±0.56）%，而對照組胰腺外分泌細胞凋亡指數(shù)為（17.68±0.41）%，對照組明顯低于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；胰島細胞無統(tǒng)計學差異。⑤細胞涂片免疫組化SP結果顯示凋亡細胞呈棕褐色染色，實驗

11、組P53染色陽性率為（10.65±0.45）%，對照組P53染色陽性率為（8.32±0.30）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑥術后5天冰凍切片的TUNEL凋亡檢測結果：實驗組小鼠的熒光著色的外分泌細胞明顯少于對照組。實驗組胰腺外分泌細胞凋亡指數(shù)為（18.35±0.45）%，而對照組胰腺外分泌細胞凋亡指數(shù)為（10.23±0.23）%，對照組明顯低于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；胰島細胞凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學差異。⑦

12、術后5天胰蛋白酶免疫組化結果：對照組中胰島細胞周圍充斥有大量的深棕色的抗胰蛋白酶抗體陽性顆粒，而實驗組中未見明顯的深棕色顯色。對照組陽性顆粒數(shù)為（80±4），實驗組陽性顆粒數(shù)為（15±3），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：⑴生長抑素可以誘導小鼠胰島移植過程中損傷的胰腺外分泌細胞凋亡，而對胰島細胞凋亡沒有影響。⑵生長抑素可以通過誘導胰腺外分泌細胞凋亡，與凋亡調控基因P53的表達成正相關。⑶在胰島移植中應用生長