布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：布魯氏菌病作為一種人畜共患病，嚴重威脅著環(huán)境及人類身體健康，建立一種快速、可靠的布魯氏菌檢測方法，對其預(yù)防及診斷都具有重要意義。而熒光定量PCR檢測技術(shù)是一種公認的簡單、靈敏、快速的檢測方法。但是，在諸多布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法的報道中，人們沒有意識到抑制物的存在將影響本方法用于樣品檢測的準確性及可靠性。因此本文建立了一種含兩種內(nèi)參基因的布魯氏菌熒光定量PCR方法，在快速、靈敏的檢測布魯氏菌的同時，質(zhì)控樣品DNA及PCR檢測

2、過程，提高檢測結(jié)果的可靠性及準確度。
　　方法：以哺乳動物beta-actin基因為內(nèi)源性內(nèi)參基因，質(zhì)控樣本DNA；以重組質(zhì)粒為外源性內(nèi)參基因，質(zhì)控PCR擴增過程。針對布魯氏菌屬特異性基因IS711，建立用于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法，優(yōu)化布魯氏菌引物濃度、探針及反應(yīng)溫度，并驗證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性，做標準曲線。將該方法用于樣品檢測，并與細菌分離培養(yǎng)檢測結(jié)果比較。之后，將陽性樣品進行布魯氏菌的SNP基因分型。

3、　　結(jié)果：⑴確立了將哺乳動物的beta-actin基因作為內(nèi)源內(nèi)參基因，并設(shè)計出特異性引物及探針。用于質(zhì)控樣品DNA提取物；選取大西洋鮭魚β-球蛋白基因片段，建立了外源重組質(zhì)粒作為外源性內(nèi)參，用于質(zhì)控PCR擴增。⑵建立并優(yōu)化了布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法。⑶建立布魯氏菌標準品，制作標準曲線：只擴增布魯氏菌DNA時，相關(guān)系數(shù)R2為0.999(Y=-3.34X+42.85)；擴增布魯氏菌和外源重組質(zhì)粒時，相關(guān)系數(shù) R2為0.997(Y=-

4、3.13X+40.50)；同時擴增布魯氏菌及內(nèi)外源性內(nèi)參基因時，相關(guān)系數(shù) R2為0.997(Y=-3.12X+40.9)。說明加入的外源及內(nèi)源內(nèi)參基因?qū)Σ季鷻z測沒有太大影響。本檢測方法的檢測線達5.6拷貝·μL-1，在特異性檢測中，布魯氏菌引物及探針只擴增了六種經(jīng)典布魯氏菌，對陰性參考菌均無非特異性擴增。而且，本檢測方法穩(wěn)定性良好。⑷將本方法用于樣本檢測，共檢測了30份動物組織樣品，360份動物全血，91份奶樣，其中檢測出7份布魯氏菌陽