Keap1-Nrf2通路在子癇前期氧化應激發(fā)病機制中調控作用的研究.pdf

1、子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特有的臨床綜合征，以妊娠20周后出現新發(fā)高血壓和蛋白尿為主要特點，其發(fā)病率約為2-9.4％。PE是發(fā)展中國家產婦死亡和發(fā)病的主要原因之一，但是PE發(fā)生發(fā)展的病理機制尚不清楚。目前，PE發(fā)展進程可分為以下兩個階段:第一階段是胚胎滋養(yǎng)層入侵到母體子宮肌層，導致子宮螺旋動脈重塑不足，從而使胎盤陷入缺血和缺氧環(huán)境，引發(fā)胎盤釋放多種促炎細胞因子和血管生成因子等，引起母體全身炎癥。第二階段，全身炎癥

2、反應所導致的母體血管系統(tǒng)的內皮功能障礙與腎功能下降引起的血壓升高為此階段的主要特征，最終引起以母體高血壓和蛋白尿為主要表現的臨床綜合征。緩解母體癥狀的唯一有效途徑是胎盤和胎兒的娩出。既往研究表明，PE患者的胎盤氧化應激反應失衡，并且胎盤局部氧化應激過度，可誘發(fā)滋養(yǎng)細胞生物學功能損傷，導致滋養(yǎng)細胞凋亡增加和侵襲能力下降，引起母親系統(tǒng)性血管內皮功能失調和白細胞激活;而Keap1/Nrf2信號通路則在PE的氧化應激損傷中發(fā)揮保護作用，但是其作

3、用機制尚不清楚。因此，深入探討PE的氧化應激發(fā)生機制，尋求有效的治療靶點，對緩解PE患者癥狀、延長胎兒在母體時間、降低PE患者死亡率具有重要臨床意義。
　　氧化應激(Oxidative Stress，OS)是機體的應激反應，即體內的活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)及活性氮族(Reactive Nitrogen Species，RNS)產生過多，清除過少，最終導致氧化/抗氧化體系失衡，傾向于氧化，引

4、起組織損傷。與非妊娠狀態(tài)相比，正常妊娠期間母體活性氧生成量增加。隨著胎盤成熟，血管形成，胎盤被變成富氧環(huán)境，活性氧的增加刺激妊娠期間抗氧化系統(tǒng)的增強。增強的抗氧化系統(tǒng)有效補償了OS的氧化作用。與正常妊娠相比，PE患者OS表達增加和抗氧化系統(tǒng)的表達增強，其特征在于活性氧(ROS)在循環(huán)和組織中表達增加。
　　既往研究結果顯示Keap1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1)/N

5、rf2(nuclear factor-E2-related factor2)信號通路在抗氧化、抗炎方面扮演了重要的角色。正常狀態(tài)下，細胞質中的Nrf2與其負調控因子Keap1結合形成Keap1/Nrf2復合物，大部分Nrf2被Keap1介導的泛素化降解，因此其處于活性相對抑制狀態(tài);而應激的狀態(tài)會引起Keap1構象的改變，或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2磷酸化，導致Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2進入細胞核，形成下一步

6、連鎖反應，從而與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)的結構相結合，激活下游的多種抗氧化基因。因此Keap1/Nrf2信號調節(jié)通路在PE的發(fā)病過程中有著重要的作用，研究該機制具有重要臨床意義。
　　目的:
　　1.明確不同分組氧化應激水平的變化及Nrf2對于氧化應激水平的抑制作用。通過檢測不同分組HTR8/SVneo細胞內CAT、GSH-Px、SOD酶活性，進一步明確Nrf2對于氧

7、化應激相關活性酶作用的機制。
　　2.在前期實驗工作基礎上，進一步從細胞水平-臨床水平，采用蛋白印跡雜交、qRT-PCR、siRNA、ELISA等相關技術手段的，明確Keap1/Nrf2通路對PE細胞模型中滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo生物學功能以及PE患者氧化應激水平的影響。
　　方法:
　　對于人早孕期絨毛外滋養(yǎng)細胞株HTR8/SVneo進行細胞培養(yǎng)、復蘇、傳代。通過活性氧及氧化應激相關酶CAT、GSH-Px及SOD

8、酶活性的測定，以明確不同分組HTR8/Svneo及胎盤組織氧化應激水平;并通過檢測血漿MMPs預測子癇前期的發(fā)病風險。應用RNAi方法設計siRNA-Nrf2，對靶基因進行基因沉默實驗，以明確靶基因的功能;應用qRT-PCR方法確認Keap1/Nrf2通路與氧化應激相關分子的轉錄水平的差異，Western blot方法確認Keap1/Nrf2通路與氧化應激相關分子蛋白的表達差異。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數土標準差(Me

9、ans±SD)表示，兩組間均數的比較采用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001均為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.qRT-PCR檢測轉染慢病毒后Nrf2mRNA表達結果示:Si-Nrf2組較Si-NC組Nrf2mRNA的表達量明顯減低(P＜0.001);蛋白免疫印跡法檢測Nrf2蛋白的表達量，結果顯示:Si-Nrf2組較Si-NC組明顯降低，差異有顯

10、著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　2.HTR8/SVneo細胞H/R組ROS水平與Non-treated組相比明顯升高(p＜0.01);對Nrf2進行基因沉默后，Nrf2siRNA+H/R組ROS水平與H/R組相比明顯增高(p＜0.01)。
　　3.HTR8/SVneo細胞在缺氧/復氧條件下，氧化應激相關酶(CAT、GSH-Px、SOD)活性顯著低于處理前，這體現在H/R組氧化應激酶水平較正常對照組明顯降低(P＜0.01

11、)。SiRNA+H/R組HTR8/SVneo細胞內CAT、GSH-Px、SOD活性下降顯著(P＜0.01)。
　　4.缺氧復氧后HTR8/SVneo細胞Keap1mRNA表達輕度低于正常對照(P＜0.05);HTR8/SVneo細胞缺氧復氧后Nrf2mRNA表達明顯高于正常對照組(P＜0.001);HTR8/SVneo細胞缺氧復氧后HO-1mRNA表達水平明顯高于正常細胞(P＜0.001)。
　　5.HTR8/SVneo細胞

12、缺氧復氧后Keap1蛋白表達水平明顯低于正常對照組(P＜0.05);而缺氧復氧后HTR8/SVneo細胞Nrf2蛋白表達水平明顯高于正常細胞(P＜0.001);HO-1蛋白表達水平在缺氧復氧后也明顯高于正常細胞(P＜0.001)。
　　6.正常孕婦和重度子癇前期患者的孕周、收縮壓、舒張壓以及新生兒體重均存在統(tǒng)計學差異。
　　7.孕中期PE患者的MMP-2水平高于正常參與者，但沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。另一方面，PE患者

13、MMP-9血漿水平略低于正常懷孕組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。比較MMP-2/MMP-9比率，發(fā)現PE組的比率明顯高于正常妊娠組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　MMP-2用于預測PE的ROC曲線下面積僅為0.563，95％置信區(qū)間(CI)為0.497-0.629(P＞0.05)。而MMP-9的預測PE的ROC曲線下面積為0.587，95％CI為0.522-0.652，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。ROC

14、曲線下使用MMP-2/MMP-9比率預測PE的曲線下面積為0.841，95％CI為0.797-0.886(P＜0.001)。
　　8.重度子癇前期患者胎盤組織CAT(P＜0.001)、GSH-Px(P＜0.01)、SOD(P＜0.01)酶活性均低于正常胎盤組織。
　　9.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1mRNA表達水平稍低于與正常胎盤組織(P＜0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2mRNA表達水平明顯高于與正常胎盤組

15、織(P＜0.001);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1mRNA表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.001)。
　　10.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1蛋白表達水平稍低于與正常胎盤組織(P＜0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2蛋白表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.01);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1蛋白表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P＜0.01)。
　　結論:
　　本研究通過檢測不同類型HTR

16、8/SVneo細胞內活性氧、CAT、GSH-Px、SOD酶活性，進一步明確氧化應激時活性氧水平上升、其相關酶活性下降及Nrf2對于氧化應激相關活性酶作用的機制;在mRNA及蛋白水平，Keap1/Nrf2信號通路在缺氧復氧狀態(tài)下表達水平明顯改變，提示可通過調節(jié)Keap1/Nrf2信號通路抑制氧化應激的水平。孕中期患者血漿MMPs水平對子癇前期有重要的預測意義。不同樣本的氧化應激相關活性酶因臨床狀態(tài)不同而有明顯差異;重度子癇前期患者胎盤組織