DKK4促進(jìn)肺癌多西他賽耐藥及其機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是臨床上最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率及致死率較高，嚴(yán)重威脅患者健康。大多患者就診時(shí)已至晚期，無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)，多采用化療為主的綜合治療。多西紫杉醇（又名多西他賽）在非小細(xì)胞肺癌化療中都有良好的臨床療效，但是其耐藥問(wèn)題是化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因。因此研究其耐藥的分子機(jī)制，對(duì)提高患者生存期和改善預(yù)后具有重要意義。
　　DKK4是Dickkopf家族蛋白的一種，定位于染色體8p11.2-p11.1，是一種分泌性糖蛋白，通過(guò)抑制Wn

2、t/β-catenin信號(hào)通路的活性，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)行為。DKK4與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在結(jié)腸癌、腎癌組織中高表達(dá)，但DKK4與肺癌的關(guān)系不是非常清楚。
　　本研究首先分析了耐藥/親本細(xì)胞株的表達(dá)譜，對(duì)比肺癌A549多西他賽耐藥株與親本株A549的差異基因，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平差別在倍以上的差異表達(dá)基因共有392個(gè)。其中，A549多西他賽耐藥株中DKK4表達(dá)比親本株上調(diào)5倍，驗(yàn)證了DKK4在A549/DTX細(xì)胞中高表達(dá)。然后進(jìn)行了體外驗(yàn)證D

3、KK4表達(dá)水平與多西他賽耐藥的相關(guān)性，結(jié)果顯示A549/DTX細(xì)胞干涉DKK4后檢測(cè)喪失多西他賽耐藥性，過(guò)表達(dá)DKK4后，A549細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)DKK4與肺癌多西他賽耐藥密切相關(guān)。在下一步的研究中，我們對(duì)DKK4促進(jìn)肺癌A549多西他賽耐藥作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，結(jié)果顯示:DKK4高表達(dá)抑制JNK，干涉DKK4通過(guò)活化JNK促進(jìn)casepase3活化引起細(xì)胞凋亡，干涉DKK4通過(guò)活化JNK抑制Bcl-2表達(dá)從而引起細(xì)胞凋亡，同

4、時(shí)A549/DTX細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)DKK4促進(jìn)克隆形成以及增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，造成細(xì)胞對(duì)DTX耐藥。
　　綜上所述，本研究首次對(duì)DKK4與肺癌多西他賽耐藥相關(guān)性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步研究，意義在于為肺癌治療提供新的治療靶點(diǎn)和新的治療策略。
　　第一部分 A549/DTX細(xì)胞中DKK4表達(dá)情況研究
　　目的:證實(shí)A549/DTX細(xì)胞中DKK4高表達(dá)。
　　方法:Realtime PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定A549/

5、DTX細(xì)胞株中DKK4 mRNA水平;Westernblot檢測(cè)DKK4蛋白水平檢測(cè);ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中DKK4的表達(dá).
　　結(jié)果:與親本株相比，DKK4在A549/DTX細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。
　　結(jié)論:DKK4在A549/DTX細(xì)胞中高表達(dá)，提示DKK4可能與肺腺癌多西他賽耐藥相關(guān)。
　　第二部分 體外DKK4表達(dá)水平與多西他賽耐藥呈正相關(guān)的研究
　　目的:體外驗(yàn)證DKK4表達(dá)水平與多西他賽耐藥的相

6、關(guān)性
　　方法:首先驗(yàn)證A549/DTX細(xì)胞干涉DKK4后喪失多西他賽耐藥性。用siRNA抑制DKK4表達(dá)，用MTT檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞抑制率及測(cè)定半數(shù)致死劑量(IC50)。流式檢測(cè)SiRNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4后DTX誘導(dǎo)的A549/DTX細(xì)胞凋亡情況。然后過(guò)表達(dá)DKK4，用Real-time PCR檢測(cè)DKK4 mRNA過(guò)表達(dá)差異，MTT法測(cè)定DTX對(duì)肺癌A549過(guò)表達(dá)DKK4后細(xì)胞的IC50。
　　結(jié)果: MTT檢測(cè)結(jié)果表

7、明:SiRNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4對(duì)肺癌A549/DTX細(xì)胞抑制率顯著提高。IC50顯著降低。Si-RNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4促進(jìn)DTX誘導(dǎo)的A549/DTX細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)DKK4結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染干涉DKK4對(duì)肺癌A549細(xì)胞DTX的IC50明顯升高。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明:A549/DTX細(xì)胞干涉DKK4后檢測(cè)喪失多西他賽耐藥性，過(guò)表達(dá)DKK4后，A549細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)DKK4與肺腺癌多西他賽耐藥呈正相關(guān)。
　　第

8、三部分 DKK4作用的分子機(jī)制研究
　　目的:揭示DKK4促進(jìn)A549/DTX細(xì)胞對(duì)多西他賽耐藥的分子機(jī)制
　　方法:采用Western blot檢測(cè)信號(hào)通路磷酸化，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外增殖能力，用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:Western blot檢測(cè)提示干涉DKK4可促進(jìn)JNK磷酸化，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果:JNK抑制劑PD600125部分恢復(fù)干涉DKK4引起B(yǎng)cl-

9、2表達(dá)下調(diào)。JNK抑制劑PD600125部分阻斷干涉DKK4引起的細(xì)胞凋亡。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:A549/DTX細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)DKK4促進(jìn)克隆形成以及細(xì)胞遷移能力。Transwell法檢測(cè)結(jié)果:A549/DTX-SiRNA侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　結(jié)論:(1) DKK4高表達(dá)抑制JNK，干涉DKK4通過(guò)活化JNK促進(jìn)casepase3活化引起細(xì)胞凋亡，干涉DKK4通過(guò)活化JNK抑制Bcl-2表達(dá)從而引起細(xì)胞凋亡。(2)A549/