內質網應激相關基因DDIT3調控腫瘤細胞自噬與凋亡的分子機制研究.pdf

1、癌癥已成為人類最主要的致死疾病之一，嚴重威脅著人類的壽命。我國的腫瘤發(fā)病情況更是不容樂觀。根據世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球癌癥報告2014》，2012年全世界共新增1400萬癌癥病例并有820萬人死亡。其中，中國新增307萬癌癥患者并造成約220萬人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。肺癌仍然是全世界發(fā)病率和致死率最高的癌癥，2012年新增肺癌病例180萬，死亡人數159萬，其中中國因肺癌死亡的的人數超過全世界的1/3?；瘜W療法是

2、目前治療癌癥的重要手段之一，然而臨床上應用的化療藥物還存在著副作用強和引發(fā)耐藥性等問題，因此尋找安全高效的化療藥物就顯得尤為重要。
　　內質網是真核細胞中蛋白質合成、折疊與分泌的重要細胞器。內源或外源的刺激會導致內質網的蛋白質折疊功能紊亂所引起的一種細胞應激狀態(tài)稱為內質網應激。內質網應激會通過非折疊蛋白反應來清除內質網中的錯誤折疊蛋白并維持內質網的穩(wěn)態(tài)。如果內質網應激無法逆轉，會引起細胞功能惡化進而引起細胞的死亡。越來越多的證據表

3、明，內質網應激在多種腫瘤中廣泛存在，并與腫瘤細胞的存活和耐藥性密切相關。因此，針對內質網應激信號通路設計和開發(fā)抗腫瘤靶向性藥物成為目前研究的熱點。
　　細胞自噬和細胞凋亡是調控腫瘤細胞命運的兩個重要過程，但二者之間的關系尚不清楚。在腫瘤細胞中，內質網應激既可通過細胞自噬影響細胞的存活或死亡，又可直接誘導細胞死亡。但內質網應激反應如何通過調控腫瘤細胞的自噬和凋亡來決定細胞的命運尚不完全清楚。因此，探討腫瘤細胞中內質網應激對細胞自噬和

4、細胞凋亡的影響具有重要的理論意義，并且在靶向化療藥物的設計和開發(fā)上具有實際的應用價值。
　　內質網應激是由未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網腔內積累所引起的。其中未折疊蛋白能使內質網分子伴侶HSPA5和與其結合的三種內質網應激感受器蛋白EIF2AK3、ERN1和ATF6解離，進而該三種跨膜蛋白得以激活。激活后的ERN1通過非常規(guī)形式對XBP1前體mRNA的一段26nt的內含子進行剪切，剪切后的mRNA發(fā)生翻譯框移碼，編碼成為具有轉錄

5、活性的轉錄因子XBP1S(Xboxbindingprotein1splicing)。XBP1S作為轉錄因子可以上調參與內質網相關性蛋白降解途徑(ERassociateddegradation，ERAD)的相關基因的表達，以調節(jié)內質網對蛋白質質量的控制和維持氧化還原狀態(tài)平衡。同時，ERN1還可以招募TRAF2和ASK1基因以激活p38MAPK和JNKMAPK信號通路。EIF2AK3通過介導轉錄起始因子EIF2A的磷酸化進而抑制蛋白質翻譯而

6、使細胞進入暫時的“靜止期”。在這種情況下，轉錄因子ATF4以不依賴帽狀結構的方式進行選擇性的翻譯，上調參與維持內質網穩(wěn)態(tài)的基因的表達。從HSPA5釋放后，ATF6轉移至高爾基體，由高爾基體蛋白酶S1P(site1protease)和S2P(site2protease)進行切割。被切割的片段作為轉錄因子調節(jié)參與ERAD和維持內質網穩(wěn)態(tài)的幾個相關基因的表達。在UPR過程中，DDIT3是UPR的3個感受器共同的靶基因，即ERN1、ATF6和E

7、IF2AK3均可以上調CHOP表達。
　　DDIT3最早作為一個C/EBPs的成員被鑒定出來，發(fā)揮著C/EBPs的顯性負抑制劑的作用。DDIT3又被稱GADD153、CHOP和C/EBPζ。C/EBPs作為一個轉錄因子家族對多種基因進行調控，這些基因廣泛參與免疫功能、細胞分化和細胞增殖等生理學過程。目前為止，已經鑒定出6個C/EBP家族成員，分別為:C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和DDIT3。

8、DDIT3與C/EBP家族其他成員或JUN/FOS家族成員形成異源二聚體，從而作為轉錄因子參與在應激過程中誘導表達的基因的轉錄調控。DDIT3蛋白含有兩個功能結構域:一個N端轉錄激活域(transactivitydomain)和一個C端的堿性-亮氨酸拉鏈(basicleucinezipper，bZIP)結構域。已有的文獻證實，DDIT3作為轉錄因子既可介導BBC3和BCL2L11的轉錄，又可介導TNFRSF10B的轉錄從而參與內質網應激

9、誘導的細胞凋亡過程。而最近的研究表明，DDIT3還可以對許多自噬相關基因進行間接或直接調控（如DDIT3作為轉錄因子通過調節(jié)TRIB3和ATG5的表達參與細胞自噬），從而參與由細胞自噬介導的促存活過程。因此，DDIT3可能通過調控細胞凋亡和細胞自噬這兩個相互拮抗的生物過程之間的平衡進而影響細胞的命運。然而，DDIT3是否還存在其他誘導細胞自噬的分子機制以及DDIT3誘導的細胞自噬與細胞凋亡的關系等問題尚不清楚。
　　因此，本研究課

10、題旨在探討和研究內質網應激相關基因DDIT3如何調控腫瘤細胞的自噬和凋亡;DDIT3所介導的細胞自噬和細胞凋亡之間的關系以及DDIT3介導的細胞自噬和細胞凋亡對腫瘤細胞命運的影響。以期為內質網應激反應對細胞自噬和凋亡的調控機制提供新的實驗證據，并為抗腫瘤的靶向化療藥物的設計和開發(fā)提供依據。
　　1.內質網應激相關基因DDIT3調控腫瘤細胞自噬的分子機制研究
　　1.1DDIT3作為轉錄因子調控腫瘤細胞自噬的分子機制研究

11、>　　Salinomycin（鹽霉素）是第一個通過高通量的篩選系統鑒定出的能特異性殺死腫瘤干細胞的化合物。該化合物能選擇性的殺死乳腺癌及其他腫瘤干細胞，但其具體的分子機制尚不清楚。因而了解其作用機制對于研究腫瘤干細胞特性、腫瘤耐藥及開發(fā)新型抗腫瘤藥物具有重要的意義。在人的非小細胞肺癌細胞中，我們發(fā)現:(1)Salinomycin能明顯上調MAP1LC3B蛋白的表達;(2)Salinomycin能誘導代表自噬小體的熒光亮點聚集;(3)通過

12、siRNA干擾技術抑制自噬相關基因ATG5和ATG7的表達或利用自噬早期抑制劑（3-MA或LY294002）抑制自噬流后，Salinomycin誘導的MAP1LC3B的蛋白表達明顯下調并且熒光亮點明顯減少;(4)利用自噬晚期抑制劑(bafilomycinA1或chloroquine)抑制自噬流后，Salinomycin誘導的MAP1LC3B的蛋白表達明顯上調并且熒光亮點明顯增加。這些結果證實，在人的非小細胞肺癌細胞中，Salinomyc

13、in誘導了細胞自噬。我們在進一步的研究中發(fā)現Salinomycin誘導的細胞自噬與內質網應激相關:(1)Salinomycin能明顯上調內質網應激相關蛋白ERN1、p-EIF2A、ATF4和DDIT3的表達，并能誘導XBP1mRNA的切割;(2)利用siRNA技術抑制ATF4和DDIT3后，Salinomycin誘導的MAP1LC3B蛋白表達明顯下調;(3)利用化合物4-PBA抑制內質網應激過程后，Salinomycin誘導的MAP1L

14、C3B蛋白表達明顯下調。通過對Salinomycin誘導細胞自噬分子機制進一步的研究，我們證實Salinomycin通過內質網應激抑制MTOR通路，即ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路誘導細胞自噬的發(fā)生。此外，我們還發(fā)現在人的非小細胞肺癌細胞中，Salinomycin誘導的細胞自噬對促進細胞存活具有重要的作用。另外，為了證實Salinomycin在腫瘤干細胞樣的細胞中是否存在相同的機制，我們利用A549細

15、胞構建了能穩(wěn)定抑制E-cadherin基因CDH1表達的A549/shCDH1細胞系。我們發(fā)現Salinomycin在A549/shCDH1細胞中同樣能通過ATF4-DDIT3/DDIT3-TRIB3-AKT1-MTOR通路誘導細胞自噬;同時我們還發(fā)現A549/shCDH1細胞對Salinomycin更為敏感，這表明通過抑制細胞自噬對腫瘤干細胞進行靶向治療可能是最有希望的策略之一?？傊覀兊倪@些發(fā)現表明利用Salinomycin聯合細

16、胞自噬抑制劑可能是殺死腫瘤細胞和腫瘤干細胞的一種有效的治療手段。
　　1.2DDIT3通過與ATG5相結合調控腫瘤細胞自噬的分子機制研究
　　DDIT3作為轉錄因子通過調控TRIB3或ATG5的表達間接或直接誘導細胞自噬，但對于DDIT3是否還存在其他誘導自噬的途徑尚不清楚。在本課題中，我們發(fā)現DDIT3通過三個方面對ATG5進行調節(jié)進而調控自噬過程:1）我們在A549、H157、H1792和293FT細胞中發(fā)現DDIT3能

17、上調ATG5的表達，與最近的文獻報道一致，即DDIT3作為ATG5的轉錄因子促進ATG5的表達;2）我們通過免疫共沉淀實驗證實DDIT3可以與ATG5、ATG12-ATG5復合物及ATG16L1相結合，并且免疫熒光實驗結果也顯示，在細胞質中DDIT3與ATG5及ATG16L1存在共定位現象;另外，通過GSTpull-down實驗我們發(fā)現DDIT3能促進ATG12-ATG5復合物與ATG16L1的結合以形成ATG12-ATG5-ATG16

18、L1復合體，進而促進自噬小體的形成;(3)根據已有的文獻報道，鈣網蛋白Calpain可在ATG5的Thr193進行剪切，形成24kD和9kD兩個片段，24kD的ATG5片段會轉移至線粒體外膜上進而介導細胞凋亡。在本課題中，我們發(fā)現DDIT3可與ATG5的C端的區(qū)域（194-274aa）結合，并且當DDIT3過表達時可明顯抑制由doxorubicin或TG誘導的鈣蛋白酶calpain對ATG5的剪切;另外，我們發(fā)現DDIT3可以減緩ATG

19、5的降解的降解速度，進而維持ATG5的穩(wěn)定。此外，我們初步探討了ATG5也可對DDIT3進行調控-1）我們發(fā)現當ATG5過表達時可明顯抑制DDIT3的降解速度，進而維持DDIT3的穩(wěn)定性;(2)我們發(fā)現在A549細胞中，TG、cisplatin、doxorubicin及etoposide可誘導ATG5從細胞質轉移至細胞核中并增強了DDIT3對TNFRSF10A和TNFRSF10B的反式激活作用。總之，在本課題中我們首次揭示了DDIT3可

20、通過促進ATG5的表達、抑制其降解和促進ATG12-ATG5-ATG16復合體的形成等三個方面參與對自噬的調控，并且我們首次初步探討了ATG5對DDIT3的調控。這些發(fā)現將豐富我們對DDIT3調控自噬和凋亡的分子機制的認識。ATG5和DDIT3之間的相互調控可能是促進細胞自噬與凋亡之間串擾的新機制。
　　2.內質網應激相關基因DDIT3調控腫瘤細胞凋亡的分子機制研究
　　2.1DDIT3通過上調TNFRSF10A和TNFRS

21、F10B的表達介導腫瘤細胞凋亡的分子機制研究
　　腫瘤壞死因子受體超家族成員10a（TNFRSF10A，又稱DR4或TRAIL-R1）和腫瘤壞死因子受體超家族成員10b（TNFRSF10B，又稱DR5或TRAIL-R2）是兩種細胞表面受體，可與腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)結合從而介導外源凋亡途徑。已有的文獻證實，內質網應激誘導劑可通過TNFRSF10A和TNFRSF10B介導細胞凋亡。大量文獻證實，DDIT3可以作

22、為轉錄因子通過調控TNFRSF10B的轉錄進而上調TNFRSF10B的表達介導細胞凋亡。然而，對TNFRSF10A的轉錄調控的分子機制尚不清楚。在本課題中，我們利用內質網應激誘導劑TG和Tm處理人非小細胞肺癌細胞A549、H460和H1792后發(fā)現:(1)DDIT3和TNFRSF10A的表達均明顯上調，且DDIT3的表達上調時間較TNFRSF10A要早些;(2)DDIT3過表達后TNFRSF10A的表達明顯增加;(3)利用siRNA干擾

23、技術抑制DDIT3表達后，TNFRSF10A的表達明顯減少。這些結果證實DDIT3可調控TNFRSF10A的表達。為證實DDIT3是否作為轉錄因子調控TNFRSF10A的轉錄，我們預測并證實在TNFRSF10A啟動子區(qū)存在兩個假定的DDIT3結合位點(-1636/-1625;-371/-364)和一個假定的AP-1結合位點(-304/-298)。通過螢光素酶活性實驗，我們證實在三個假定的結合位點中AP-1結合位點的功能最為活躍。而且，我

24、們發(fā)現在TNFRSF10A啟動子區(qū)的AP-1結合位點（-304/-298）區(qū)域，DDIT3可以和phospho-JUN直接結合從而形成DDIT3/phospho-JUN異源二聚體。此外，我們發(fā)現一種重要的組蛋白乙酰轉移酶KAT2A和DDIT3存在物理性結合。為了探究KAT2A是否也參與TNFRSF10A/B的轉錄調控，我們進行了3個實驗并發(fā)現:(1)利用siRNA干擾技術抑制KAT2A的表達后TNFRSF10A/B的表達會明顯下調;(2

25、)利用螢光素酶活性檢測實驗我們發(fā)現在KAT2A表達抑制時TNFRSF10A/B啟動子的活性明顯下調;(3)通過染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗，我們發(fā)現KAT2A可能參與了KAT2A/DDIT3/phospho-JUN復合體或KAT2A/DDIT3復合體的形成，KAT2A可能通過乙?；疕3K9/K14進而促進TNFRSF10A/B的轉錄。此外，我們還證明了在人的非小細胞肺癌細胞中，TNFRSF10A參與了由內質網應激誘導劑介導的細胞凋亡