用HPLC-MS-MS法進行nodosin在大、小鼠體內的藥代動力學研究.pdf

1、研究背景:
　　唇形科(Labiatae)香茶菜屬（Isodon）植物系多年生草本、灌木或半灌木植物，全屬約計150余種，供藥用的有30余種，具有清熱解毒、健脾活血、抗菌消炎等功效，某些種類民間作為抗癌藥用。生物活性研究結果表明該屬植物具有的生物活性廣泛，從中提取分離得到的多個二萜類成分具有顯著的抗腫瘤活性。顯脈香茶菜Isodon neivosus(Hemsl.)C.Y.Wu et H.W.Li系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，民間

2、以全草入藥，具有清熱、除濕、解毒等功效。從顯脈香茶菜中分離出的一系列二萜類化合物中，屬于α-亞甲基環(huán)戊酮單元對映-貝殼杉烷型的二萜類化合物顯示出良好的抗腫瘤活性。
　　Nodosin，為6，7斷裂-對映-貝殼杉烷型五環(huán)二萜化合物，是從顯脈香茶菜中分離出的天然對映-貝殼杉烷型二萜，對人慢性粒細胞白血病K512細胞、人白血病HL60細胞、人結腸癌LOVO細胞、乳腺癌MCF-7細胞、神經母細胞瘤SHSY5Y細胞、小鼠B16-F10黑色素

3、瘤細胞、急性早幼粒細胞白血病NB4細胞、肺癌A549細胞和前列腺癌細胞PC-3均具有不同程度的抑制或殺傷作用。
　　Nodosin對膠質瘤細胞的生長也具有明顯的選擇性抑制作用并對膠質瘤細胞具有細胞增殖抑制作用，對大鼠膠質瘤C6細胞和人膠質瘤U87細胞的IC50分別是25.81μM、11.05μM。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)這種作用通過阻滯細胞周期于G2/M期以及下調cyclinBl和cdc2蛋白水平來實現(xiàn)。同時，nodosin具有誘導膠質

4、瘤細胞凋亡的作用，并能通過促進細胞微管解聚以及下調MMP-9蛋白水平來抑制膠質瘤細胞的遷移侵襲。同時，前期研究首次在體內實驗中發(fā)現(xiàn)nodosin能抑制裸鼠內膠質瘤的腫瘤生長及減少腫瘤重量，具有體內抗惡性膠質瘤作用。
　　到目前為止，有關單體化合物nodosin在體內的吸收、代謝等相關藥代動力學特征尚不清楚。為滿足新藥的研究與開發(fā)需要，本課題建立了利用HPLC-MS/MS測定生物樣品中nodosin含量的方法，用以對nodosin在

5、大、小鼠體內開展系統(tǒng)的藥代動力學探索性研究。
　　研究目的:
　　本項研究目的在于在本實驗室前期對nodosin體內、外抗惡性膠質瘤的研究基礎上，進一步進行nodosin在小鼠體內的吸收、分布及在大鼠體內的吸收、排泄研究，探索nodosin的藥代動力學。首先通過HPLC-MS/MS手段建立一個簡單、靈敏專屬性強的測定生物樣品中nodosin含量的方法，利用此方法測定大、小鼠的血藥濃度來研究nodosin的吸收及其相關的藥代動

6、力學參數(shù);其次通過測定小鼠肝臟及腦組織中nodosin的含量來研究其在肝臟里面藥物的分布情況及其是否透過血腦屏障;最后通過測定大鼠尿液和糞便中nodosin的含量來掌握其排泄情況。
　　研究方法
　　首先實驗選擇齊墩果酸作為內標化合物并優(yōu)化色譜及質譜條件，建立一個HPLC-MS/MS測定生物樣品中nodosin含量的方法。利用液液萃取法進行生物樣品的前處理，考察不同的萃取溶劑、溶劑量及萃取時間對液液萃取法進行優(yōu)化，參考文獻考

7、察在樣品處理過程中對基質效應及回收率影響的因素，得到最優(yōu)的樣品處理方法，最后進行專屬性、精密度、回收率等方法學驗證。
　　其次進行大、小鼠體內實驗，實驗設計SD大鼠和KM小鼠單次腹腔注射nodosin生理鹽水(1 mg·kg-1)，給藥后于不同時間點（段）采集生物樣品，并用LC-MS/MS測定生物樣品中nodosin的濃度，最后通過DAS3.2.6藥動學軟件計算nodosin藥動學參數(shù)。
　　研究結果:
　　(1)建立

8、了一個靈敏度高、專屬性強的HPLC-MS/MS測定生物樣品中nodosin含量的方法。結果顯示nodosin在3.9～1000 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好(r2＞0.99)，定量限為3.9 ng·mL-1。提取回收率在74.2％以上，日內和日間精密度RSD均小于9.8％，準確度RE范圍在-1.6％～10.8％之間。表明該方法靈敏度和準確度高，成熟穩(wěn)定，能夠滿足分析大量樣品的需要。
　　(2)通過動物實驗確定了nodosi