骨髓間充質干細胞體外聯(lián)合嗅粘膜來源神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷.pdf

1、脊髓損傷作為臨床常見中樞神經系統(tǒng)損傷，可導致?lián)p傷平面以下部分或完全的運動、感覺和自主神經功能障礙等嚴重后果。時至今日，通過復雜的治療和強化的功能訓練雖可帶來少許的恢復，但治療過程緩慢，效果有限，并對較嚴重的脊髓損傷作用十分有限。目前針對較嚴重的脊髓損傷來說臨床上尚無可獲得顯著功能恢復的治療手段。干細胞療法可在實現結構修復的同時對功能恢復有所助益，目前作為脊髓損傷治療的一個潛在手段被廣泛關注。本研究將聯(lián)合使用骨髓間充質干細胞和嗅粘膜來源神

2、經干細胞進行脊髓損傷模型的聯(lián)合移植治療。試圖使兩種細胞優(yōu)勢互補，增強其治療能力。其理論依據在于:由于骨髓間充質干細胞在脊髓損傷的急性期可以調節(jié)免疫反應，而神經干細胞可以促進神經元的修復和軸突的重新長出。
　　第一部分:嗅粘膜來源神經干細胞和骨髓間充干細胞的提取和鑒定
　　目的:
　　使用水平振蕩法提取大鼠骨髓間充質干細胞并對其純度和分化能力進行鑒定;提取大鼠嗅粘膜來源的神經干細胞，并對其進行鑒定。
　　方法:

3、r>　　無菌條件下從股骨和脛骨中抽出骨髓腔內的骨髓，反復吹打將骨髓基質制成細胞懸液，離心后貼壁培養(yǎng)。將原代骨髓基質細胞放入恒溫搖床內進行搖動4小時，棄上清后傳代培養(yǎng)。使用流式細胞儀對獲得的BMSCs的純度進行鑒定，成骨成脂誘導培養(yǎng)證明其分化能力。無菌條件下剝離大鼠嗅粘膜組織，從中提取神經干細胞，培養(yǎng)后取神經球消化傳代。使用免疫組化染色對所取細胞進行鑒定。
　　結果:
　　所獲得的BMSCs，CD29和CD90的陽性細胞比例分

4、別為99.1％和9.19％，而表達CD31和CD45的陽性細胞比率分別為0％和1.3％。經過成骨和成脂誘導培養(yǎng)后，可向成骨細胞和脂肪細胞分化，產生鈣鹽結節(jié)和脂滴。從嗅粘膜提取的神經干細胞培養(yǎng)時可呈典型的神經球，使用免疫熒光染色顯示P75、S100、Nestin、GFAP抗體陽性。
　　結論:
　　水平振蕩法可高效穩(wěn)定地獲得大鼠骨髓間充質干細胞，減少傳代培養(yǎng)次數，細胞純度較高，具有分化潛能。從嗅粘膜提取的神經干細胞具有培養(yǎng)過程

5、中具有神經球的典型特征，神經干指標鑒定陽性。
　　第二部分:大鼠嗅粘膜來源神經干細胞和骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)
　　目的:
　　分析大鼠骨髓間充質干細胞和嗅粘膜來源神經干細胞體外直接共培養(yǎng)后分泌神經相關營養(yǎng)因子的情況及對神經元抗凋亡能力的影響。了解大鼠骨髓間充質干細胞和嗅粘膜來源神經干細胞體外間接共培養(yǎng)后的相互作用情況。
　　方法:
　　將大鼠骨髓間充質干細胞和嗅粘膜來源神經干細胞體外直接共培養(yǎng)后，測定其上清

6、液中神經營養(yǎng)因子-3(NT-3)和神經生長因子(NGF)的含量，并與單一細胞上清液進行比較。將BMSCs和ONSCs進行非接觸共培養(yǎng)，使用熒光定量PCR測定共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)條件下，兩種細胞mRNA中Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、NSF-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表達含量。提取胎鼠神經元細胞，使用炎癥因子(IL-1β)對神經元進行刺激后，將神經元分別與BMSCs、OM-NSCs以及BMSCs混合OM-NSCs

7、進行非接觸共培養(yǎng)，使用TUNNEL和MAP-2免疫熒光染色測定神經元的凋亡率。
　　結果:
　　單獨培養(yǎng)時，BMSCs培養(yǎng)上清液中含NGF最多含NT-3最少，而OM-NSCs中含NT-3最多而NGF最少，直接共培養(yǎng)后上清液的NGF和NT-3含量居中。經過共培養(yǎng)后BMSCs比單獨培養(yǎng)時MMP-2、MMP-9和MMP-13表達量降低而MAP-2、GFAP、Tuj1表達量增高;Nestin先降低，后升高，而NSF-1先升高后降低。

8、經過共培養(yǎng)后OM-NSCs比單獨培養(yǎng)時NSF-1表達量降低而Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、MMP-2、MMP-9和MMP-13表達量增高。所有干細胞都會對降低炎癥因子刺激后神經元的凋亡率，其中兩種干細胞混合后的效果最為明顯。
　　結論:
　　兩種干細胞直接共培養(yǎng)后分泌的生長因子可互為補充。在非接觸共培養(yǎng)條件下，BMSCs可以幫助OM-NSCs維持干性，OM-NSCs則會促進BMSCs的神經分化。OM-NSCs

9、使得BMSCs遷徙能力下降，而BMSCs會促進OM-NSCs遷徙能力的提高。兩種干細胞混合后，對神經元的抗凋亡能力的保護最為明顯。
　　第三部分:嗅粘膜來源神經干細胞和骨髓間充質干細胞聯(lián)合移植在治療大鼠脊髓損傷中的作用
　　目的:
　　觀察嗅粘膜來源神經干細胞和骨髓間充質干細胞聯(lián)合移植對大鼠脊髓損傷的治療效果，并與骨髓間充質干細胞或嗅鞘細胞單獨移植進行比較。
　　方法:
　　制備大鼠下胸段脊髓打擊損傷模型。

10、將造模的大鼠隨機分為4組，組1，單純BMSCs移植治療組;組2，單純ONSCs移植治療組;組3，BMSCs和ONSCs共移植治療組（兩種細胞比例1∶1）;組4，無菌PBS緩沖溶液注射陰性對照組。在造模后立即進行細胞移植，即在損傷部位周圍注射4×104個細胞進行治療。于細胞移植前、移植后第1天、第3天、第7天、第14天對大鼠進行運功功能評估。在移植后14天后處死大鼠，取脊髓病理標本進免疫熒光染色進行評估。
　　結果:
　　細胞

11、移植后第14天，對照組、BMSCs移植組、OM-NSCs移植組和BMSCs+OM-NSCs移植組的BBB評分分別為5.6±0.8、7.6±1.1、9.6±1.5和10.8±1.3。其中治療組的評分均較移對照組有明顯改善。BMSCs和OM-NSCs聯(lián)合移植組的BBB評分較兩個單一干細胞移植組明顯升高。免疫熒光顯示移植的BMSCs和OM-NSCs均能遷移至脊髓損傷區(qū)，并能在損傷區(qū)存活。
　　結論:
　　大鼠嗅粘膜來源神經干細胞和