中性粒細(xì)胞胞外陷阱的糖皮質(zhì)激素調(diào)控與在感染性角膜炎中的觀察研究.pdf

1、研究背景：
　　感染性角膜炎是世界性的常見(jiàn)致盲眼病，具有發(fā)病率高，視力損害嚴(yán)重的特點(diǎn)。角膜感染的主要病原有細(xì)菌、真菌和病毒等。國(guó)內(nèi)外研究表明細(xì)菌性角膜炎主要病原菌主要是革蘭陽(yáng)性球菌，以葡萄球菌最為常見(jiàn)，其次為革蘭陰性桿菌，以綠膿桿菌最為常見(jiàn)。感染性角膜炎的病理過(guò)程包括病原體的致病因子對(duì)角膜的毒性作用以及宿主識(shí)別病原體的入侵后啟動(dòng)的防御反應(yīng)。中性粒細(xì)胞作為角膜抗感染固有免疫第一道防線，在角膜感染早期病原體的殺滅與炎癥控制及對(duì)病變發(fā)展

2、與預(yù)后具有關(guān)鍵作用。特別在細(xì)菌性角膜感染中，中性粒細(xì)胞遷移至炎癥部位，吞噬病原體，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)并脫顆粒釋放抗菌肽殺傷病原體，同時(shí)產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)趨化更多的細(xì)胞浸潤(rùn)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病原體的殺滅與清除，對(duì)于角膜早期感染的控制具有重大意義。最近發(fā)現(xiàn)一種稱之為中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的新的中性粒細(xì)胞殺菌機(jī)制。所謂NETs是中性粒細(xì)胞在感染部位主動(dòng)釋放大

3、分子DNA作為網(wǎng)狀支架，對(duì)病原菌進(jìn)行包圍及限制，通過(guò)附著于DNA支架上的組蛋白和顆粒蛋白殺滅病原菌的過(guò)程。研究者在許多炎癥性疾病觀察到NETs的形成，認(rèn)為其在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。如何通過(guò)調(diào)控NETs的形成來(lái)改變這些疾病的病變發(fā)展和預(yù)后成為人們研究的重點(diǎn)。
　　糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎作用，對(duì)許多慢性炎癥、過(guò)敏性、自身免疫性疾病的病變治療與病情緩解具有不可替代的作用。但糖皮質(zhì)激素可抑制抗感染免疫應(yīng)答，故在許多感染性疾病的臨床治

4、療中是否使用激素一直存在爭(zhēng)議。如何判斷糖皮質(zhì)激素使用的適應(yīng)癥，成為許多臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。深入研究糖皮質(zhì)激素的免疫調(diào)控機(jī)制，對(duì)于臨床上合理選擇和使用藥物、制定更為有效的治療方案等具有重要的參考價(jià)值，以達(dá)到既能高效清除病原菌又能減少組織損傷的目的。
　　NETs作為感染免疫中的重要因素，其受糖皮質(zhì)激素的調(diào)控顯然也會(huì)影響到整個(gè)藥物使用對(duì)疾病的效應(yīng)。然而，NETs的體內(nèi)形成機(jī)制還未完全闡明，在眼部疾病中的研究更是屈指可數(shù)。本文我們主

5、要就糖皮質(zhì)激素對(duì)NETs的形成與殺菌率的干預(yù)作用以及NETs形成在感染性角膜炎發(fā)生發(fā)展中的作用加以研究。
　　研究方法：
　　本研究體外實(shí)驗(yàn)部分采用分離自健康志愿者外周血的原代中性粒細(xì)胞及培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化的人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60。金黃色葡萄球菌和經(jīng)典的NETs刺激物PMA用來(lái)誘導(dǎo)NETs形成。免疫熒光染色后顯微鏡下觀察NETs的形態(tài)。而地塞米松對(duì)NETs形成的干預(yù)主要通過(guò)sytox green染色與熒光顯微鏡拍照，胞外

6、游離DNA定量檢測(cè)（picogreen DNA檢測(cè)試劑盒）及細(xì)菌負(fù)荷率檢測(cè)方法來(lái)比較。實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism6.1軟件。
　　同時(shí)本研究采集了9例感染性角膜炎患者的角膜病灶組織刮片，予免疫熒光染色并熒光顯微鏡下觀察NETs的形成。結(jié)合患者的病史（發(fā)病時(shí)間，既往用藥）、病程、預(yù)后及檢驗(yàn)科直接涂片鏡檢和刮片培養(yǎng)結(jié)果，分析NETs形成與角膜炎發(fā)生發(fā)展預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)免疫熒光

7、染色法，我們驗(yàn)證了金黃色葡萄球菌和PMA可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和分化的HL-60細(xì)胞形成NETs。這種新的細(xì)胞殺菌機(jī)制可以殺滅金黃色葡萄球菌。地塞米松預(yù)處理可以抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和分化的HL-60細(xì)胞的NETs形成并降低其殺菌效率;但對(duì)于PMA誘導(dǎo)的NETs形成，我們未觀察到地塞米松預(yù)處理產(chǎn)生顯著效應(yīng)。
　　2、感染性角膜炎患者病灶組織刮片免疫熒光染色可以檢測(cè)到NETs的存在。結(jié)合患者病史，發(fā)現(xiàn)NETs的形成影響病變的