TSGL-Ig在肝缺血再灌注損傷中的作用和機制研究.pdf

1、背景:
　　在器官獲得，器官移植，器官部分切除，創(chuàng)傷或休克過程中，缺血再灌注損傷(IRI)所引起的局部無菌性炎癥反應是一個先天性免疫的必然標志性事件。在移植后的早期階段缺血再灌注損傷常會導致肝臟失去功能或肝臟功能障礙，并可能導致急性和慢性排斥反應事件的發(fā)生率增加。此外，由于邊緣性的肝臟受到缺血再灌注損傷尤其明顯和嚴重，缺血再灌注損傷是造成供肝短缺的情況的重要因素。肝臟內(nèi)皮細胞(LECs)是肝血竇的血管壁的重要組成。肝臟內(nèi)皮細胞在控

2、制血管穩(wěn)態(tài)、血管炎癥、血管張力，和血管清除毒物方面發(fā)揮著重要的保護性的作用。在肝臟低溫保存的過程中，肝內(nèi)皮細胞受到損傷屬于肝臟缺血再灌注損傷的一部分，可以引起移植物微循環(huán)不暢，粘附分子的表達上調(diào)，氧化應激反應增加，進一步放大和加強中性粒細胞浸潤和損傷作用，進而引起肝細胞壞死。選擇素家族是表達于內(nèi)皮細胞，血小板，白細胞上的凝集素域糖蛋白，在缺血再灌注損傷初始發(fā)生過程中發(fā)揮介導初始趨化、介導白細胞聚集，以及白細胞在內(nèi)皮細胞表面粘附運動的作用

3、。在細胞瀑布樣粘附級聯(lián)過程中，P-選擇素糖蛋白-1(PSGL-1，CD162)是P-選擇素唯一已知的高親和力配體。為了進一步了解研究粘附素分子拮抗劑在肝臟缺血再灌注損傷引起的炎癥和細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用，我們構(gòu)建了一個新的可溶性重組融合抗體，即“TSGL-Ig”，其中“T”的意思為“tandem”，就像馬車并排的兩匹馬一樣，有雙重的PSGL-1結(jié)合位點。已經(jīng)有大量的體內(nèi)和體外實驗研究表明，相較于先前的重組PSGL-Ig，該TSGL-

4、Ig被賦予了更高的與選擇素結(jié)合的能力，作為競爭性拮抗劑拮抗白細胞與選擇素的結(jié)合。氧化應激引起的活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生是肝臟缺血再灌注損傷過程中肝細胞損傷關鍵性的病理生理因素。Keap1-Nrf2-AREs信號通路在處理過量的活性氧的生產(chǎn)，以及維持細胞的氧化還原平衡及代謝發(fā)揮不可缺少的作用。因此，本研究試圖闡明缺血再灌注損傷氧化應激過程中內(nèi)皮細胞受損的分子機制，并為TSGL-Ig在肝移植中的使用并提高患者預后提供實現(xiàn)可能的依據(jù)。

5、>　　目的:
　　本研究旨在通過模擬臨床相關的小鼠原位肝移植模型來檢驗在肝移植供肝被長時間冷保存過程中TSGL-Ig在減少肝缺血再灌注損傷中的療效和機制。實驗預計TSGL-Ig會黏附到內(nèi)皮細胞的選擇素上，并在缺血再灌注損傷減少中發(fā)揮關鍵作用。我們想知道TSGL-Ig是否通過引起內(nèi)皮細胞Nrf2蛋白活化增加并進入細胞核，并引起下游抗氧化應激基因激活來發(fā)揮維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。我們設想TSGL-Ig在小鼠肝移植模型中是通過粘附于內(nèi)皮細

6、胞上的選擇素引起Keap1-Nrf2-AREs通路依賴的途徑來減少來保護內(nèi)皮細胞，減少細胞損傷，并以此作為提高肝移植患者的預后的切實有效治療方法。
　　方法:
　　1.動物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠(WT)及C57BL/6野生型小鼠背景下肝臟Nrf2基因條件性敲除小鼠（基因敲除檢測至少十二代以上）。
　　2.原位肝移植模型。從WT或Nrf2 KO小鼠取得的肝臟被存儲在20小時4℃UW液中在植入同種受體之前

7、。三組WT受體在肝切除時和再灌注之前接受TSGL-Ig，rPSGL-Ig，或?qū)φ彰庖咔虻鞍滋幚怼?br>　　3.熱缺血再灌注損傷模型。在小鼠肝節(jié)段70％熱缺血再灌注損傷模型。
　　4.肝細胞功能檢測。測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，以評估肝臟缺血再灌注損傷的嚴重程度。
　　5.組織病理學。肝臟標本(4μm)，用蘇木精和伊紅染色(H&E)，雙盲法分析肝臟的結(jié)構(gòu)損傷情況。
　　6.髓過氧化物酶活性測定。髓過氧化物酶(

8、MPO)是作為中性粒細胞在肝臟中積累的指標。
　　7.熒光定量PCR。用PCR進行肝臟細胞因子及趨化因子表達情況分析，以及檢測Nrf2下游基因的表達狀態(tài)。
　　8.Western blot。用來分析肝移植模型中Nrf2蛋白在細胞質(zhì)和細胞核中的表達情況。
　　9.細胞培養(yǎng)。小鼠原代細胞提取后培養(yǎng)在完全DMEM培養(yǎng)基中。
　　10.乳酸脫氫酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶釋放試驗。測定細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶

9、釋的含量，來測定培養(yǎng)原代肝細胞的損傷水平。
　　11.統(tǒng)計分析。所有值都表示為平均值土標準差(SD)的形式。p＜0.05被認為有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.TSGL-Ig提高了提高小鼠原位肝移植后的生存率，并且改善和減少了肝缺血再灌注損傷。首先，我們發(fā)現(xiàn)TSGL-Ig處理過的小鼠接受同種原位肝移植術后，比對照免疫球蛋白處理組的生存率明顯要高，超過90％的TSGL-Ig處理組小鼠在接受移植后14天仍然存活，對

10、照免疫球蛋白處理組的存活率不到TSGL-Ig處理組的一半。隨后，我們用血清學分析移植受體肝細胞功能，H&E染色觀察肝組織病理切片結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TSGL-Ig處理組的肝臟保護程度要明顯優(yōu)于對照組。
　　2.在原位肝移植模型中TSGL-Ig抑制中性粒細胞和巨噬細胞聚集。實驗結(jié)果提示與TSGL-Ig顯著降低肝移植模型中缺血過程中性粒細胞和巨噬細胞聚集。髓過氧化物酶活性測定實驗與免疫組化的數(shù)據(jù)一致，TSGL-Ig組的中性粒細胞活動降低。

11、>　　3.TSGL-Ig抑制缺血再灌注介導的肝細胞因子及其趨化因子表達。熒光定量PCR結(jié)果提示移植6小時后，相對于對照組免疫球蛋白處理組，TSGL-Ig處理組的中性粒細胞/單核細胞源性炎癥趨化因子(CXCL-1，CXCL-10)和細胞因子(TNF-α，IL-1β and IFN-β)均被抑制減少。
　　4.TSGL-Ig缺血再灌注引起的肝臟氧化應激和細胞壞死/凋亡。
　　5.TSGL-Ig調(diào)節(jié)缺血再灌注誘導的內(nèi)皮細胞激活。再

12、灌注后損傷急性期P/E選擇素和VCAM-1/ICAM-1的表達先明顯上升，其后緩慢下降。并且， TSGL-Ig在原位肝移植模型中顯著減少了內(nèi)皮細胞相關的細胞黏附分子基因的表達。
　　6.TSGL-Ig通過Nrf2依賴的通路來保護內(nèi)皮細胞免受缺血再灌注損傷。Western Blot實驗證明原位肝移植模型中缺血再灌注損傷會引起細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的Nrf2表達增高。TSGL-Ig處理組引起Nrf2相關的下游靶基因(Trx，GCL，NQO1

13、，and HIF-1α)表達升高。體外實驗同樣也證實了這一點。然后我們用Nrf2條件性敲除小鼠來探究TSGL-Ig的細胞保護機制并且發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號通路被阻斷后，內(nèi)皮細胞更易受到氧化應激損傷。與野生型小鼠相比，Nrf2條件敲除小鼠的原代內(nèi)皮細胞雖然經(jīng)過TSGL-Ig預處理，并不能起到保護內(nèi)皮細胞的作用。
　　7.缺血再灌注損傷環(huán)境下，Nrf2通路在TSGL-Ig表現(xiàn)的肝保護作用過程中起到了不可缺少的作用。
　　結(jié)論: