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文檔簡介
1、目的:先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是小兒外科常見的先天畸形之一,居消化道畸形第一位,在新生兒的發(fā)病率為1/5000~1/1500。雖然近年來對肛門直腸畸形的治療方式有了很大的改善,術后監(jiān)護也取得了很大水平進步,這使得患者整體預后得到了顯著改善,但是通過對ARMs患者長時間的隨訪發(fā)現(xiàn),很多ARMs患者在手術后仍然存在便秘、便失禁等肛腸功能障礙相關的并發(fā)癥,對患者的日常生活帶來很多不便,對他
2、們的生理、心理健康造成了非常嚴重的影響?;颊咝g后仍然存在肛腸功能障礙是由多種因素導致的,如盆底肌發(fā)育障礙、支配盆底肌的神經(jīng)分布出現(xiàn)異常、腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良和骶尾椎發(fā)育不良等。其中,盆底橫紋肌復合體(Striated Muscle Complex,SMC)是控制排便功能的關鍵因素之一,所以SMC發(fā)育異常是影響ARMs術后患者排便功能最重要的原因之一。正常胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)異?;虬l(fā)育障礙導致了患者發(fā)生肛門直腸畸形。引起患者在胚胎期肛門直腸
3、發(fā)育障礙的具體原因尚不清楚,目前,很多學者認為肛門直腸畸形的發(fā)生很大程度上受到遺傳因素的影響。研究已經(jīng)證實,在肛門直腸畸形患者中,肛門直腸存在畸形的同時多伴隨發(fā)生不同程度的橫紋肌復合體發(fā)育異常。雖然為了闡明肛門直腸畸形橫紋肌復合體異常發(fā)育的機制,人們進行了大量的研究,但是,迄今為止,其胚胎異常發(fā)育機制尚不清楚。前期的大量動物實驗表明:SMC胚胎發(fā)育的時期是E16-E21,與正常組相比,ARMs組的SMC在E16、E17時在形態(tài)與走形上沒
4、有明顯差異,但是從E18開始,SMC開始向頭側、腹側及中線方向移位,即向直腸盲端下方聚集,并會合于直腸盲袋后下方的中線上,呈現(xiàn)倒“V”字結構。在高倍鏡下可見肌纖維走行紊亂,在肌束間可以觀察到有大量結締組織浸潤。凋亡在正常SMC的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用,異常凋亡可能是引起肛門直腸畸形大鼠SMC發(fā)育異常的原因之一。此外,ARMs大鼠SMC存在肌衛(wèi)星細胞結構和功能的異常,這也可能導致SMC發(fā)育不良。也有研究顯示,與同一時間點的正常
5、組相比,Wnt5a在ARMs組SMC表達下調,這種表達的不平衡性表明Wnt5a在肛門直腸畸形胎鼠盆底SMC的異常發(fā)育過程中發(fā)揮了非常重要的作用。干細胞信號網(wǎng)絡調節(jié)異常是先天畸形發(fā)生的原因之一,而這種調節(jié)異常往往是因為表觀遺傳和基因改變造成的。研究已經(jīng)證實,Wnt信號通路與其他的分子信號通路在作用上有相互交叉,包括Shh,BMP/TGF-β,F(xiàn)gf和Notch,這些共同構成了干細胞信號網(wǎng)絡。BMPs是TGF-β超家族的亞群,在肌衛(wèi)星細胞的
6、激活和增殖過程中發(fā)揮著至關重要的作用,并且能夠阻止過早的肌源性分化。BMPs通過與細胞表面受體結合從而啟動信號轉導級聯(lián),而且形成由兩個二聚體(Ⅰ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體)組成的異四聚體復合物。此外,研究發(fā)現(xiàn),刺激BMP信號通路可導致處于激活狀態(tài)的衛(wèi)星細胞數(shù)量增加,以及處于分化狀態(tài)的成肌細胞數(shù)量減少。而且,研究表明,BMP4、BMP7在胚胎后腸的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用,BMP4、BMP7在后腸的表達下調,可能
7、導致了ARMs后腸的異常發(fā)育。然而,BMP4、BMP7在ARMs異常發(fā)育的SMC中的作用尚不清楚。當前針對肛門直腸畸形術后患兒仍然存在肛腸功能障礙的問題,提出了許多治療措施來加強盆底肌的功能,以期得到更好的排便控制,諸如生物反饋訓練、電刺激括約肌與骶神經(jīng)以及內(nèi)外括約肌成形術等的這些措施主要通過重新建立神經(jīng)反射弧以及改變直腸肛管角度等方面以使患者得到更好的排便控制,盡管這些措施從一定程度上改善了ARMs術后患者的肛腸功能障礙的癥狀,但是隨
8、訪發(fā)現(xiàn)這些措施的遠期效果并不是十分理想,因為這些措施并沒有從根本上解決控制排便的盆底橫紋肌復合體存在異常發(fā)育的問題。目前,針對ARMs患者存在的發(fā)育不良的SMC這一問題,臨床上通常將股薄肌、臀大肌等肌肉移植到發(fā)育不良的SMC區(qū)域來部分代償SMC的功能,但是因為控制排便的盆底肌的肌纖維是耐疲勞的Ⅰ型肌纖維,而這些肌肉的肌纖維是易疲勞的Ⅱ型肌纖維,而且支配這些肌肉與盆底肌肌纖維的神經(jīng)分布不同,排便反射的反射弧無法正常建立,難以達到理想的遠期
9、效果。細胞移植作為修復損傷和改善預后的一種新的治療思路,現(xiàn)在越來越受到人們的普遍關注。肌衛(wèi)星細胞在正常情況下處于靜止狀態(tài),定植于骨骼肌纖維基底膜下,當骨骼肌組織受到病理刺激或者損傷后,位于基底膜下的衛(wèi)星細胞迅速活化,增殖以及融合,從而便于處于病理狀態(tài)的肌纖維發(fā)生迅速修復和再生。本文應用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)對Wistar大鼠進行致畸,建立肛門直腸畸形動物模型,探索正常胎鼠及ARMs胎鼠在盆底SMC胚胎發(fā)育過
10、程中差異表達的基因,以及BMP4、BMP7時空表達存在的差異,同時通過提取骨骼肌衛(wèi)星細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖,攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒轉染后移植入ARMs胎鼠發(fā)育異常的SMC區(qū)域,并在移植后觀察肌衛(wèi)星細胞在體內(nèi)存活、分化情況,探索肌衛(wèi)星細胞移植治療ARMs發(fā)育不良SMC的可行性。
方法:⑴動物模型制各及標本收集。Wistar大鼠,體重250~300 g,10~12周齡,由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供,雌雄鼠以5∶1比例
11、交配,次日清晨陰道涂片,置于顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)載玻片上有精子者則定為孕0天(E0),于E10經(jīng)胃管注入1% ETU(125 mg/kg)致畸,制作ARMs大鼠動物模型,對照組給予等量的生理鹽水。選擇E17、E19、E21三個時間點,用10%水合氯醛(3.2 ml/kg)腹腔注射麻醉孕鼠,然后剖宮取胎,一部分標本取其盆底部放于4%多聚甲醛溶液中進行固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常溫保存,用于切片進行免疫組化染色;另一部分標本在
12、解剖顯微鏡下取盆底SMC組織,深度冰箱凍存,用于Western Blotting及qRT-PCR實驗。⑵應用Agilent全基因表達譜芯片對差異表達基因進行篩查。在E17、E21取正常組及ARMs組SMC組織,進行“Agilent全基因表達譜芯片”實驗(上海伯豪生物技術有限公司提供)。篩查正常組和ARMs組中可能存在的差異表達的基因,以及參與其中的信號通路;并運用qRT-PCR對其中與后腸發(fā)育和骨骼肌發(fā)育相關的基因進行驗證。⑶BMP4及
13、BMP7在兩組大鼠胚胎SMC發(fā)育過程中表達的研究。應用免疫組化方法觀察BMP4及BMP7蛋白在大鼠胚胎晚期SMC發(fā)育過程中的時空表達模式;應用Western Blotting的方法對BMP4及BMP7蛋白進行定量分析;運用qRT-PCR技術對在正常組和ARMs組大鼠胚胎發(fā)育過程中盆底肌中BMP4及BMP7的mRNA表達水平進行定量分析,初步探索兩種基因在SMC發(fā)育過程中可能起到的作用。⑷子宮內(nèi)肌衛(wèi)星細胞移植修復盆底橫紋肌復合體。應用兩步
14、消化法從出生3天內(nèi)新生雄鼠后肢提取肌衛(wèi)星細胞,并利用差速貼壁法進行純化,然后進行體外培養(yǎng)增殖,應用免疫熒光染色法對肌衛(wèi)星細胞進行鑒定,肌衛(wèi)星細胞經(jīng)攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-eGFP)轉染后,移植入ARMs胎鼠的SMC區(qū)域,觀察移植后肌衛(wèi)星細胞在ARMs胎鼠體內(nèi)SMC區(qū)域存活及分化情況,初步探索子宮內(nèi)移植肌衛(wèi)星細胞治療ARMs胎鼠發(fā)育不良的SMC的可行性。⑸統(tǒng)計分析。所有的實驗數(shù)據(jù)均以均值±標準差來表示,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件
15、進行統(tǒng)計學分析,各胎齡正常組與ARMs組差異的比較采用t檢驗,移植后胎鼠存活率的比較采用卡方檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
結果:①全基因表達譜芯片篩查(篩查條件為:Fold Change cut-off:2.0,P-value cut-off:0.05)結果顯示:ARMs組較Normal組E17下調基因296個,上調基因180個,E21下調基因250個,上調基因230個。運用qRT-PCR技術對其中與后腸發(fā)育和骨骼
16、肌發(fā)育相關的差異基因進行驗證,結果顯示qRT-PCR的結果與表達譜芯片的結果趨勢基本一致。②對BMP4蛋白及mRNA的定性及定量研究發(fā)現(xiàn),ARMs胎鼠SMC中BMP4表達明顯減弱。正常組中,從E17到E21,隨著胚胎的發(fā)育,BMP4表達逐漸增強。而在ARMs組中,同一時間點BMP4的表達明顯較正常組減弱,并且隨時間推移這種差異表達越明顯。③通過對比研究BMP7蛋白及mRNA在兩組胚胎SMC組織中的時空表達,發(fā)現(xiàn)在正常組中,BMP7蛋白在
17、E17時在SMC中有表達,在E19時BMP7表達強度明顯升高,在SMC及球海綿體肌中均可以看到BMP7標記的陽性細胞,在E21時BMP7表達降低,表達位置沒有變化。而在ARMs組,與正常組同時間點相比,BMP7表達明顯減弱,但是表達趨勢與正常組一致。④提取的肌衛(wèi)星細胞在體外培養(yǎng)后48h后Desmin染色陽性,體外培養(yǎng)72h后Myosin染色陽性。肌衛(wèi)星細胞經(jīng)Ad-eGFP轉染后移植到ARMs胎鼠SMC區(qū)域,移植后肌衛(wèi)星細胞在ARMs胎鼠
18、體內(nèi)存活,并表達骨骼肌細胞骨架蛋白Desmin以及成熟骨骼肌細胞特異性標記Myosin。
結論:⑴大鼠盆底橫紋肌復合體的胚胎期發(fā)育是一個非常復雜的過程。全基因表達譜芯片篩查結果提示正常組和ARMs組中差異表達的基因較多,并且有較多信號傳導通路參與,這些差異表達的基因及所在的信號傳導通路可能是導致ARMs胎鼠SMC異常發(fā)育的原因。⑵E17-E21,BMP4和BMP7在ARMs組SMC中的表達較正常組弱,BMP4和BMP7的低表達
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