基于KanR篩選建立研究Group I intron結構與功能的系統與Terythraeum II型內含子歸巢機制的研究.pdf

1、Ⅰ型基因內含子和Ⅱ型基因內含子同屬于自我剪接型核酶，它們是具有催化活性的RNA分子，能夠催化自身從前體RNA中自我剪接并連接其側翼的外顯子從而形成成熟的RNA分子。Ⅰ型基因內含子的二級結構主要包括10個配對區(qū)，其自我剪接需要一外源的鳥苷協助，催化是由兩個連續(xù)的磷酸酯鍵轉移反應完成的。典型的Ⅱ型基因內含子的二級結構由六個莖環(huán)結構域以車輪狀放射分布組成（結構域Ⅰ-Ⅵ），其中結構域Ⅳ環(huán)區(qū)包含一個開放閱讀框，編碼一個多功能的蛋白質。該蛋白質一般

2、具有反轉錄酶、成熟酶和核酸內切酶三種活性，這些活性對于Ⅱ型基因內含子剪接及其移動性都有著重要的作用。Ⅱ型基因內含子的自我剪接與Ⅰ型基因內含子的差別在于其自我剪接無需外源的鳥苷協助，而是由其靠近3’端外顯子的突起腺苷A所引發(fā)。
　　 本論文中的第一部分是在大腸桿菌中建立基于卡那霉素抗性篩選研究Ⅰ型基因內含子結構與功能的系統。Ⅰ型內含子一直是研究RNA結構與功能的理想模型，圍繞這類分子實施的堿基突變試驗一直是此項研究的主要手段。海洋

3、藍細菌Nostoc punctiforme的核糖核酸還原酶基因上存在一個Ⅰ型基因內含子，該內含子含有383個堿基，并包含一段新的插入序列，此前研究表明這個內含子在大腸桿菌中能夠發(fā)生自我剪接反應。本實驗室首先將Npu RIR內含子的全部序列插入到pDrive質粒載體的卡那霉素抗性基因中，構建了pKR12質粒。由于該內含子處于異源基因之中并且它的插入并不攜帶其天然的外顯子，所以喪失了固有的剪接活性，含有該質粒的大腸桿菌不能在卡那霉素抗性LB

4、平板上生長。隨后我們采用易錯PCR對Npu RIR內含子進行定向進化，成功的獲得了大量突變內含子，然后構建重組質粒突變庫，轉化后在含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB平板上篩選獲得了大量的克隆。經過菌液PCR、酶切等一系列的鑒定排除假陽性以后，初步篩選得到了34個突變的質粒，這些質粒轉化進入大腸桿菌以后能夠表現出穩(wěn)定的卡那霉素抗性。實驗選取其中的一個突變子pKR12m-3進行RT-PCR鑒定，鑒定結果表明該突變的內含子在卡那霉素抗性基因中具有

5、剪接活性。由此，成功地建立起一個用于實施堿基突變實驗來研究1型基因內含子RNA結構與功能的新系統?；谶@個系統，具有剪接活性的基因內含子可以很容易的通過KanR篩選而獲得，由于intron結構和功能的相關性，進而可以獲得與其結構相關的信息。
　　 課題第二部分是在第一部分的基礎上進行的延伸，成功構建此系統以后，接著研究Npu RIR內含子的高級結構。實驗對Npu RIR內含子的P5環(huán)狀2581～2585nt處的五個核苷酸GAGA

6、T和P8環(huán)狀2815～2818nt處的四個核苷酸UUUU分別做了隨機突變。隨后的抗性平板對照試驗表明突變這兩個位點的intron失去其剪接活性，因此證明了這兩個位點對于Npu RIR內含子的結構是必須的。下一步的實驗旨在通過易錯PCR方法重新得到具有剪接活性的Npu RIR內含子，據此獲得可能與這兩個位點發(fā)生長距離相互作用的區(qū)域信息。但是目前的篩選并沒有得到陽性結果，因此未能達到最終目的，因此也無法獲得進一步高級結構信息。
　　

7、 課題第三部分初步探索了Tri chodesmium erythraeum基因組中Ⅱ型內含子的歸巢機制。實驗室已經構建了含有Ter dnaN-1內含子序列的供體質粒pDN1-C與含有TerⅡ12(DIDD)內含子序列的供體質粒pDIDD-C。在這兩個質粒的的內含子序列中引入KanR基因的開放閱讀框。而后又構建了含有Ter dnaN-1和TerⅡ12(DIDD)內含子的天然插入位點和來自Ⅱ型內含子TerⅡ8(RIR-3)編碼的成熟酶的受體

8、質粒pAM1-H2、pAM1-H3，這兩個載體攜帶氯霉素抗性基因。通過電轉化構建了含有供體質粒和受體質粒的雙質粒菌株，經過誘導表達，Ⅱ型內含子的編碼序列有可能從供體質粒上歸巢至受體質粒上的天然插入位點上，產生一個新的歸巢質粒。此歸巢質粒攜帶受體質粒上的CamR基因和來源于歸巢的Ⅱ型內含子上攜帶的KanR基因，因此轉化后有可能通過在含有卡那霉素和氯霉素兩種抗生素的LB平板上篩選得出。挑取平板上生長的單菌落，然后在歸巢位點的上下游設計引物進