核糖體蛋白L34在骨肉瘤中的表達(dá)及對人骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景:
　　骨肉瘤是對兒童和青少年的健康危害極大的惡性骨腫瘤。但是，骨肉瘤的發(fā)病率低，腫瘤異質(zhì)性較高，因此，近二十年來，研究者在提高骨肉瘤治療的效果和改善骨肉瘤患者的預(yù)后上取得的進(jìn)展甚微。核糖體蛋白L34(ribosomal protein L34，RPL34)被認(rèn)為除了參與核糖體生物合成外，還具有多種核糖體外功能。早期研究發(fā)現(xiàn)RPL34參與了原核生物的細(xì)胞增殖調(diào)控，近年來研究發(fā)現(xiàn)RPL34在部分惡性腫瘤的增殖中扮演了重要角色，但

2、在人骨肉瘤中的功能尚未明確，并且RPL34介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的分子機(jī)制仍不清楚。
　　目的:
　　明確RPL34在人骨肉瘤組織及骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況，以及對人骨肉瘤細(xì)胞增殖和骨肉瘤患者預(yù)后的影響;初步探討RPL34介導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的分子機(jī)制;通過本研究為骨肉瘤的靶向治療提供新的思路。
　　方法:
　　1、采用Real time-PCR檢測11例骨肉瘤患者的癌和癌旁組織樣本中RPL34 mRNA的

3、表達(dá)水平。
　　2、采用免疫組織化學(xué)方法檢測95例骨肉瘤患者的癌組織和60例正常骨組織中RPL34蛋白的表達(dá)水平。
　　3、計(jì)算上述95例骨肉瘤組織樣本免疫組織化學(xué)染色得分的均值，并把95例樣本劃分為RPL34高表達(dá)組和低表達(dá)組;采用Kaplan-Meier法估計(jì)RPL34高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存率，采用log-rank檢驗(yàn)比較兩組患者的生存曲線是否有差別。
　　4、采用Real time-PCR檢測人成骨細(xì)胞hF

4、OB1.19及骨肉瘤細(xì)胞株(U2OS、MG-63、HOS和Saos-2)中RPL34 mRNA的表達(dá)水平。
　　5、設(shè)計(jì)和篩選針對RPL34基因的RNA干擾靶點(diǎn)，構(gòu)建RNA干擾慢病毒并轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2，采用Real time-PCR和Western blot驗(yàn)證RPL34 RNA干擾靶點(diǎn)的敲減效率。
　　6、采用Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測、MTT檢測、細(xì)胞周期檢測、AnnexinV-APC凋亡檢測及克隆形成實(shí)

5、驗(yàn)等來評估RPL34敲減對Saos-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　7、分別基于UCSC數(shù)據(jù)庫和STING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行RPL34基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩查和蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，然后對整合關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，獲得調(diào)控RPL34基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和介導(dǎo)RPL34調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞增殖的下游相互作用蛋白。
　　結(jié)果:
　　1、11例骨肉瘤患者的癌和癌旁組織樣本中:7例(7/11，63.64％)患者的骨肉

6、瘤組織中RPL34的表達(dá)顯著高于癌旁組織;3例(3/11，27.27％)患者的骨肉瘤組織和癌旁組織中RPL34的表達(dá)無差異;1例(1/11，9.09％)患者的骨肉瘤組織中RPL34表達(dá)低于癌旁組織。
　　2、免疫組織化學(xué)檢測表明:75例(78.95％，75/95)骨肉瘤患者的癌組織染色為強(qiáng)陽性，20例(21.05％，20/95)患者的癌組織染色為弱陽性，而60例正常骨組織染色均為弱陽性;骨肉瘤組織中RPL34蛋白的表達(dá)水平明顯高于

7、正常骨組織。
　　3、對上述95例骨肉瘤患者的生存分析顯示:RPL34蛋白高表達(dá)患者的3年生存率為35.42％(17/48)，RPL34蛋白低表達(dá)患者的3年生存率為61.70％(29/47)，RPL34蛋白高表達(dá)患者的預(yù)后明顯較差。
　　4、RPL34 mRNA在4株骨肉瘤細(xì)胞(U2OS、MG-63、HOS和Saos-2)中的表達(dá)均高于人成骨細(xì)胞hFOB1.19。
　　5、RPL34表達(dá)敲減使Saos-2細(xì)胞的增殖速率

8、受到顯著抑制，細(xì)胞的集落形成數(shù)目減少，并且誘導(dǎo)了Saos-2細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯。
　　6、生物信息學(xué)分析獲得了參與RPL34基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的11個因子，即MYC及MYC相關(guān)因子X(MYC associated factor X，MAX)、CEBPB、E2F6、GABP、NFKB、NRSF、SPI1、TAF1、TBP、YY1，以及RPL34下游與其相互作用的100個蛋白;進(jìn)一步的GO和KEGG通路富集分析提示:RPL34基因的轉(zhuǎn)