山楂原花青素抗氧化作用和對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）果實(shí)酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含原花青素(proanthocyanidin，PC)等功能性成分。研究表明，原花青素是一類具有極強(qiáng)抗氧化作用的多酚化合物，從食物中攝取原花青素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗衰老，預(yù)防心血管、癌癥等疾病。探討山楂原花青素的抗肝癌活性，有望為肝癌患者的食療提供新的途徑。本試驗(yàn)研究了山楂PC提取物及其主要成分對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其對(duì)抗氧化和

2、細(xì)胞凋亡的影響。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)用DPPH法和ABTS法檢測(cè)山楂PC提取物、表兒茶素和B2在體外清除自由基的能力。結(jié)果表明在濃度1-5μg/mL范圍內(nèi)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)DPPH自由基的清除率隨樣品濃度增加而增大;在10-50μg/mL范圍內(nèi)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)ABTS自由基的清除率隨樣品濃度增加而增大。對(duì)DPPH自由基清除率的IC50分別為山楂PC提取物3.19μg/mL，B210.70

3、μg/mL，表兒茶素13.01μg/mL;對(duì)ABTS自由基清除率的IC50分別為山楂PC提取物30.50μg/mL，B295.14μg/mL，表兒茶素120.02μg/mL。試驗(yàn)證明山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)DPPH與ABTS自由基的清除率跟其濃度呈正相關(guān)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可顯著(p＜0.05)清除DPPH和ABTS自由基。
　　(2)MTT法測(cè)定山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞增殖

4、的作用。試驗(yàn)表明山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率有一定不同，在低于25μg/mL時(shí)，B2對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效果較好，在50μg/mL及100μg/mL濃度時(shí)，山楂PC提取物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效果最好。在100μg/mL處理濃度下，24h后山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的增殖抑制率分別為39.19％、24.60％和25.75％;48h后山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率分別為68.0

5、9％、52.07％和58.04％。同濃度同時(shí)間處理?xiàng)l件下，山楂PC提取物、表兒茶素和B2對(duì)HL-7702人正常肝細(xì)胞生長(zhǎng)活力無明顯影響。上述結(jié)果證明原花青素呈時(shí)間和濃度依賴性顯著（p＜0.05）抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的增殖。
　　(3)以形態(tài)觀察，DAPI染色和Western Blot法研究山楂原花青素對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用。山楂PC提取物、表兒茶素和B2處理SMMC-7721人肝癌細(xì)胞48h后，觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果原花青素

6、可誘導(dǎo)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞產(chǎn)生貼壁不牢，邊緣變圓，體積變小，數(shù)量減少，產(chǎn)生凋亡小體的凋亡形態(tài)。同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜通透性改變的現(xiàn)象，DAPI染色后，熒光顯微鏡下拍照觀察，凋亡細(xì)胞顯示出明亮的藍(lán)色熒光。Western Blot法檢測(cè)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以既通過激活Caspase-8，進(jìn)而激活Caspase-3，使PARP片段化，誘導(dǎo)SMMC

7、-7721細(xì)胞發(fā)生由死亡受體調(diào)節(jié)的細(xì)胞外源凋亡途徑，也可以通過增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)，降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而增加Bax與Bcl-2的比值，進(jìn)而激活Caspase-3，使PARP片段化，誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生由線粒體調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)源凋亡途徑。同時(shí)，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以增加抑癌基因p53的量，從而誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。試驗(yàn)證明，山楂原花青素可以誘導(dǎo)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞凋亡。
　　

8、(4)對(duì)山楂原花青素處理過的細(xì)胞中MDA含量和相關(guān)酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，山楂PC提取物、表兒茶素和B2可以呈濃度依賴性的使SMMC-7721人肝癌細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px和Na+K+-ATP酶活性降低，增加MDA的量(p＜0.05)，從而使細(xì)胞抗氧化體統(tǒng)紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中，山楂PC提取物對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞MDA、抗氧化酶和ATP酶的影響最大。
　　山楂中富含原花青素，山楂原花青素的抗癌作用將為肝癌