人羊膜來(lái)源干細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成機(jī)制探究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性進(jìn)展的炎性疾病，由內(nèi)皮損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂質(zhì)代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)等原因引起，給人民健康帶來(lái)很大威脅。目前被普遍接受的“損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間關(guān)系密切，血管內(nèi)皮細(xì)胞襯在血管內(nèi)壁，為血流提供光滑的表面，并作為半透膜，將血管內(nèi)外分開(kāi)，起屏障作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能性的損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的始動(dòng)環(huán)節(jié)。粥樣斑塊破裂常導(dǎo)致急性心肌梗死，造成心肌永久損傷，若血管內(nèi)皮細(xì)胞可以迅速反應(yīng)，通過(guò)

2、血管生成作用促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)，可以部分恢復(fù)局部缺血心肌血供，繼而促進(jìn)心梗后心功能的恢復(fù)。因此，在心血管疾病中，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成能力至關(guān)重要。hAECs和hAMSCs通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活、保護(hù)已有血管的穩(wěn)定作用和促進(jìn)缺血組織的血管再生在各種細(xì)胞治療中發(fā)揮作用。干細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確，其中旁分泌作用機(jī)制引起我們的關(guān)注，間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生許多生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，肝素結(jié)合的EGF樣

3、生長(zhǎng)因子(HBEGF)，胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)，與內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生密切相關(guān)，而羊膜上皮細(xì)胞相關(guān)研究有限。本研究的目的是:1），從人羊膜分離和鑒定人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞及人羊膜上皮細(xì)胞;2）研究這些細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能影響;3)，通過(guò)RNA-seq對(duì)比人羊膜來(lái)源的兩種細(xì)胞生長(zhǎng)因子在mRNA水平差異;4）深入探究上皮細(xì)胞旁分泌作用相關(guān)的生長(zhǎng)因子。
　　研究方法:入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(hAoECs)從Sciencell（美國(guó)）

4、購(gòu)買(mǎi)，P4-6被用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。羊膜組織通過(guò)酶消化法原代提取獲得間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞兩類(lèi)細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞方法、細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞分化能力進(jìn)行鑒定。分別從hAoECs、hAECs及hAMSCs收集條件培養(yǎng)基(CdM)，用于培養(yǎng)hAoECs，實(shí)驗(yàn)分組情況為CdM-hAoEC（對(duì)照），CdM-hAEC、CdM-hAMSC及EGM-2(陽(yáng)性對(duì)照)。我們使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力;細(xì)胞增殖試劑盒

5、(CCK-8)和細(xì)胞周期檢測(cè)來(lái)評(píng)估主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠血管生成及實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓塞實(shí)驗(yàn)以評(píng)估血管生成的能力。為了檢測(cè)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，我們對(duì)羊膜來(lái)源兩種細(xì)胞進(jìn)行了Illumina HiseqTM2500轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以FC＞2及P＜0.05篩選差異表達(dá)基因，通過(guò)Gene Otology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，以期尋找關(guān)鍵的旁分泌生長(zhǎng)因子，并通過(guò)qRT-PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(E

6、LISA)檢測(cè)收集的條件培養(yǎng)液中生長(zhǎng)因子濃度;為了進(jìn)一步探究羊膜上皮細(xì)胞旁分泌作用中發(fā)揮重要作用的生長(zhǎng)因子，我們選擇差異表達(dá)明顯，并已有商品化中和抗體的肝素樣表皮生長(zhǎng)因子(HBEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子A(TGFA)、表皮調(diào)節(jié)素(EREG)進(jìn)行研究，通過(guò)抗體特異性的中和條件培養(yǎng)液的相應(yīng)因子，觀察其在促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及成管中的作用。
　　結(jié)果:原代提取得到的上皮細(xì)胞，呈多角形，長(zhǎng)滿后呈上皮細(xì)胞特有的鋪路石樣外觀，間充質(zhì)細(xì)胞傳至3代

7、以后細(xì)胞呈成纖維樣形態(tài)、魚(yú)群狀分布。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)，hAEC: CD90(+)、CD44(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD49d(-)、CD31(-) HLA-DR(-)、SOX-2(+)、OCT3/4(+)、SSEA-4(+),hAMSC: CD90(+)、CD44(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD49d(+)、 CD

8、31（-）HLA-DR(-)、SOX-2(+)、OCT3/4(+)、SSEA-4(+);細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:上皮細(xì)胞表達(dá)CK19，而間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)CK19，hAECs和hAMSCs均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物SSEA-4、Oct-4和SOX-2。人羊膜來(lái)源兩種細(xì)胞均可向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化。收集羊膜來(lái)源細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CdM)，觀察CdM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷

9、移能力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)通過(guò)IPP軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示與CdM hAoEC相比(20.11±7.04％)，CdM hAEC(75.86±3.06％)明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移，而CdMhAMSC（29.16±5.12％）促進(jìn)遷移作用不明顯;為了進(jìn)一步驗(yàn)證條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，我們將內(nèi)皮細(xì)胞置于上室，將不同條件培養(yǎng)液置于下室，觀察條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的趨化作用，結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，CdM hAEC明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移

10、(184.01±33.66 CdM-hAEC vs.58.82±23.99 CdM-hAMSC;p＜0.05，45.20±30.04 CdM-hAoEC);通過(guò)CCK-8及細(xì)胞周期檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，與CdM hAoEC及陽(yáng)性對(duì)照EGM-2相比，CdM hAMSC明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而CdM hAEC促進(jìn)增殖作用不明顯;我們用流式細(xì)胞周期檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培

11、養(yǎng)液培養(yǎng)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞S期所占比例明顯提高(30.56±1.91％ CdM-hAMSCvs.21.61±1.54％ CdM-hAoEC)，而CdM hAEC促進(jìn)增殖作用不明顯;血管生成相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明從hAECs和hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液維持內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的穩(wěn)定性。我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究可能的旁分泌生長(zhǎng)因子，測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析得到4152個(gè)差異表達(dá)基因，將這些差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析

12、，挑選出可能旁分泌的差異基因，通過(guò)qPCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，表明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌較多的血管生成相關(guān)因子HGF、bFGF等，羊膜上皮細(xì)胞分泌IHBEGF、TGFA、EREG水平較高。我們深入研究羊膜上皮細(xì)胞旁分泌生長(zhǎng)因子對(duì)hAoEC遷移及血管生成的影響。使用不同濃度梯度的中和抗體進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，最終選定0.5ug/ml中和抗體濃度繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)加入TGFA或EREG中和抗

13、體后，可抑制hAoEC遷移，而HBEGF中和抗體對(duì)hAoEC遷移影響不大，同時(shí)使用三種中和抗體對(duì)CdM-hAEC進(jìn)行中和后，抑制hAoEC遷移作用明顯。通過(guò)中和抗體中和人羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液，觀察CdM-hAEC對(duì)hAoEC成管的改變，結(jié)果表明，同時(shí)使用三種中和抗體對(duì)CdM-hAEC進(jìn)行中和后，明顯抑制hAoEC成管作用。
　　結(jié)論:1）通過(guò)流式細(xì)胞鑒定及細(xì)胞分化能力鑒定，我們成功提取了人羊膜上皮細(xì)胞及人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞;羊膜來(lái)

14、源兩種細(xì)胞條件培養(yǎng)液均能影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，從hAECs獲得的條件培養(yǎng)液促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移;從hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖;從hAECs和hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液維持內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的穩(wěn)定性;2）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明人羊膜上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞均表達(dá)多種生長(zhǎng)因子，如EGF、HBEGF、VEGFA、bFGF、HGF，TGFA、EREG和IGF-1，qRT-PCR及ELISA進(jìn)一步驗(yàn)證人羊膜來(lái)源兩種細(xì)胞可旁分泌多種