裂解性噬菌體對耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜的作用研究.pdf

1、鮑曼不動桿菌是造成呼吸系統(tǒng)感染的常見條件致病菌，隨著多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)，臨床鮑曼不動桿菌感染的治療面臨極大挑戰(zhàn)。大部分鮑曼不動桿菌菌株能夠形成生物被膜，在增強細菌存活能力的同時也進一步提高了細菌對抗生素的耐受能力，因此，抑制或清除生物被膜是應(yīng)對細菌耐藥的重要策略之一。裂解性噬菌體能夠特異感染并裂解宿主細菌，其作用機制與抗生素不同，在抗生素耐藥日益嚴重的今天又重新受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，被認為是治療耐藥菌感染的有效補充或替

2、代手段。
　　本研究以呼吸監(jiān)護室病人痰標本中分離的1株泛耐藥鮑曼不動桿菌為指示菌，從解放軍第307醫(yī)院污水中分離出1株裂解性噬菌體。在完成基本生物學(xué)鑒定和全基因組序列分析后，采用體外實驗系統(tǒng)觀察了噬菌體對鮑曼不動桿菌生物被膜的作用效果。
　　為了研究該噬菌體的基本生物學(xué)特性，用雙層瓊脂法觀察噬菌斑大小和形態(tài)，透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，測定噬菌體的裂解譜及其一步生長曲線。為了進一步了解噬菌體的遺傳信息，用高通量測序的

3、方法得到噬菌體的全基因組序列并進行基因注釋和同源性分析。實驗結(jié)果表明，噬菌體感染宿主菌后，可在雙層瓊脂平板上形成圓形且透亮的噬菌斑，噬菌斑周圍可見明顯的暈環(huán)，說明噬菌體在感染過程中可產(chǎn)生類似解聚酶的物質(zhì);透射電子顯微鏡觀察可見噬菌體呈直徑約為48～50nm的正六面體頭部和長度約為140～150nm的可收縮長尾，形態(tài)類似肌尾噬菌體科（Myoviridae）;該噬菌體可裂解包括宿主菌在內(nèi)的9株(9/31)耐碳青酶烯類鮑曼不動桿菌且具有較短的

4、潛伏期(10min)和較大的爆發(fā)量（229pfu/cell）;噬菌體的全基因組為線性雙鏈DNA分子，長度為41243bp，G+C含量為39.3％，編碼52個ORFs，16個ORFs編碼已知功能蛋白，不含整合酶、毒力因子或類轉(zhuǎn)座子等成分，與鮑曼不動桿菌噬菌體AB3，F(xiàn)ri1，Abp1，phiAB1和vB_AbaP_PD-6A3的全基因組序列高度同源。
　　為了觀察噬菌體對細菌生物被膜的作用效果，體外培養(yǎng)鮑曼不動桿菌形成生物被膜后，利

5、用掃描電子顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、結(jié)晶紫染色半定量、生物被膜細菌計數(shù)以及生物被膜細菌ATP測定等方法評價噬菌體的作用效果。顯微鏡觀察結(jié)果表明，裂解性噬菌體能夠顯著破壞耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜。細菌定量結(jié)果表明噬菌體可以有效抑制88.5％的耐藥鮑曼不動桿菌形成生物被膜，能夠清除52％～90％的生物被膜。ATP釋放實驗也進一步證明了裂解性噬菌體可以感染并破壞細菌生物被膜，進入生物被膜細菌內(nèi)部并使之裂解。除此以外，我們發(fā)現(xiàn)無論是對數(shù)生長

6、期的鮑曼不動桿菌，還是鮑曼不動桿菌生物被膜，同樣會對噬菌體的感染產(chǎn)生耐受，對數(shù)生長期的鮑曼不動桿菌對裂解性噬菌體的不敏感突變(BIM)率為3×10-6cfu。
　　綜上所述，本研究成功分離到耐藥鮑曼不動桿菌裂解性噬菌體，鑒定了該噬菌體的基本生物學(xué)特性和基因組成分，證明了噬菌體不僅能夠有效殺滅宿主菌，而且能夠抑制并破壞宿主菌形成生物被膜，為耐藥鮑曼不動桿菌感染的治療提供了新思路，具有一定的應(yīng)用前景。然而，在本研究中也發(fā)現(xiàn)了一些亟待解