大黃酸調控Rac1-ROS-MMPs通路抑制卵巢癌細胞的浸潤轉移的作用研究.pdf

1、目的:測定大黃酸對卵巢癌淋巴結定向高轉移細胞（SKOV3-PM4）的遷移、侵襲抑制作用，探討大黃酸對NADPH氧化酶活性及ROS活性的影響及Rac1/ROS/MMPs信號通路中MMPs蛋白分子表達的影響，為研究干預卵巢癌轉移和侵襲提供新途徑。
　　方法:本研究以人卵巢淋巴結定向高轉移能力的亞克隆細胞(SKOV3-PM4)為研究對象。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測不同濃度大黃酸(rhein)處理SKOV3-PM4細胞48h后的增

2、殖抑制作用。選擇不同濃度的大黃酸與PMA(Rac1激活劑)，NSC23766（Rac1抑制劑）聯(lián)合作用，將SKOV3-PM4細胞分為9個實驗組:①Control;②rhein(7.7μM);③rhein(11.3μM);④單用PMA(100nM））;⑤PMA+rhein(7.7μM);⑥PMA+rhein(11.3μM);⑦單用NSC23766(12.5μM);⑧NSC23766+rhein(7.7μM);⑨NSC23766+rhein

3、（11.3μM）。細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力，Transwell小室侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力。NBT法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性的變化;流式細胞儀檢測各組細胞中ROS濃度的變化。Western Blot實驗方法檢測各組細胞Rac1/ROS/MMPs信號通路中關鍵蛋白及MMPs蛋白表達水平的變化。
　　結果:大黃酸能夠抑制SKOV3-PM4細胞的增殖能力，48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為34.8uM，選擇大黃酸

4、抑制率＜10％的濃度作為本研究的實驗濃度。與對照組相比.Rac1激活劑PMA處理SKOV3-PM4細胞48h后，細胞遷移能力增強，而大黃酸(11.3μM)、PMA+ rhein及NSC23766+ rhein顯著降低SKOV3-PM4遷移能力。各組細胞劃痕實驗結果與Transwell侵襲實驗結果基本一致。PMA處理SKOV3-PM4細胞48h后，NADPH氧化酶活性升高，而大黃酸(7.7μM及11.3μM)，PMA+ rhein、NSC

5、23766+ rhein處理后細胞NADPH氧化酶活性降低，與對照組相比有統(tǒng)計學差異。與空白對照組比較，PMA處理后ROS濃度顯著升高。PMA+ rhein處理后細胞內ROS濃度較單用PMA處理后的低。Western Blot實驗顯示:與空白組相比，大黃酸能顯著抑制磷酸化JNK，AP-1蛋白的表達水平，單用NSC23766、大黃酸+NSC23766處理組與單用大黃酸處理后作用效果一致。單用大黃酸(11.3μ M)處理，MMP-2，-3，

6、-7，-9及MMP-19蛋白質表達水平較空白對照組顯著降低。Rac1激活劑PMA處理組MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-19的蛋白表達水平均增高，僅MMP-7表達水平稍有降低。PMA+ rhein(11.3μM)處理后MMP-2，-3，-9，MMP-19較PMA單獨組處理后顯著降低。NSC23766處理組MMP-7，-9及MMP-19的蛋白表達水平降低，NSC23766+大黃酸處理，MMP-3，-7，-9，MMP-19蛋白質表

7、達水平較NSC23766單獨組處理降低，差異具有統(tǒng)計學意義。與空白組相比，無論高濃度還是低濃度大黃酸處理組，NM23-H1、TIMP-2和TIMP-1蛋白表達水平均升高。大黃酸抑制卵巢癌侵襲及轉移的能力，可能是通過抑制MAPK通路的JNK，AP-1蛋白磷酸化，進一步抑制MMPs，增加TIMP-1、TIMP-2和NM23-H1蛋白表達而實現(xiàn)。
　　結論:大黃酸能夠抑制卵巢癌細胞的侵襲與轉移，其作用機制可能與抑制Rac1/ROS/MM