幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌的誘變篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、幾丁質(zhì)脫乙酰酶(chitin deacetylase，CDA)是能夠脫除幾丁質(zhì)長(zhǎng)鏈分子中的N-乙?；囊环N水解酶，該酶最早由Araki等人在毛霉Mucor rouxii中獲得。目前發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)脫乙酰酶的微生物多數(shù)為真菌，從真菌中分離得到幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要為糖蛋白，分子量大多為75-150kd。幾丁質(zhì)脫乙酰酶能夠催化幾丁質(zhì)生成殼聚糖，代替工業(yè)上強(qiáng)堿法處理幾丁質(zhì)生產(chǎn)殼聚糖，酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)殼聚糖具有工藝條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)

2、點(diǎn)。幾丁質(zhì)脫乙酰酶由微生物產(chǎn)生，因此獲得幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌，提高菌株幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活值，是本課題的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。本課題從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株復(fù)壯活化開(kāi)始，誘變篩選幾丁質(zhì)脫乙酰酶高產(chǎn)菌株，主要開(kāi)展了以下研究工作:
　　從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株 Rhodococcus sp。Y-104(幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活946.11U/ml)出發(fā)，以對(duì)對(duì)硝基乙酰苯胺的脫乙酰作用為初篩指標(biāo)，對(duì)膠體幾丁質(zhì)的脫乙酰度為復(fù)篩指標(biāo)，經(jīng)活化復(fù)壯得到一株酶活值較高的菌株

3、 L79(幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活1649.07U/ml)，采用紫外線、硫酸二乙酯和紫外線-氯化鋰復(fù)合處理對(duì)菌株L79進(jìn)行誘變，經(jīng)過(guò)平板初篩和搖瓶發(fā)酵初篩、復(fù)篩篩選到一株產(chǎn)酶水平較高幾丁質(zhì)脫乙酰酶突變株 D9，產(chǎn)酶活力達(dá)到2855。36U/ml，比出發(fā)菌株酶活力提高了73.15％，對(duì)突變株D9和出發(fā)菌株L-79進(jìn)行了菌體形態(tài)分析。
　　由于菌株D9經(jīng)過(guò)多次誘變獲得，某些特性及產(chǎn)酶條件可能發(fā)生改變，對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶高產(chǎn)突變株D9進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)

4、酶條件優(yōu)化。單因素實(shí)驗(yàn)確定了適合菌株D9發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源為蔗糖，氮源為魚(yú)粉蛋白胨、玉米漿，無(wú)機(jī)鹽磷酸二氫鉀、硫酸錳以及乙酸鈉，借助Minitab軟件設(shè)計(jì)對(duì)影響CDA產(chǎn)生的六個(gè)因素進(jìn)行了Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，確定了影響菌株 D9產(chǎn)酶的三個(gè)重要因素蔗糖、魚(yú)粉蛋白胨、磷酸二氫鉀。隨后又進(jìn)行了最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳培養(yǎng)基組成，蔗糖21.26g/L，魚(yú)粉蛋白胨26.03g/L，磷酸二氫鉀0.89g

5、/L，乙酸鈉4.5g/L，玉米漿2.5g/L。對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得酶活值為6619.86U/mL。與誘變前菌株L79發(fā)酵測(cè)得的酶活值1649.07U/mL相比，酶活值提高了3.01倍。
　　幾丁質(zhì)脫乙酰酶在常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，60℃以上失活，酶最適反應(yīng)溫度為50℃，pH7.0-9.0時(shí)具有較高的穩(wěn)定性，最適pH值8.0，F(xiàn)e2+、Fe3+對(duì)酶具有顯著的抑制作用，Mn2+對(duì)酶具有較高的激活作用。
　　綜上所述，突變