小分子化合物調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白促進(jìn)巨核細(xì)胞的多倍體化.pdf

1、目的:
　　血小板是人體血液中重要的有形成分之一，其在止血、傷口愈合及炎癥反應(yīng)等生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。同時臨床的許多相關(guān)疾病都可導(dǎo)致血小板的減少，其中血液系統(tǒng)疾病、癌癥放療及大劑量化療、嚴(yán)重感染、終末期肝腎疾病等所引起的血小板減少，自身難以恢復(fù)，嚴(yán)重危害患者的生命健康，這時必須反復(fù)預(yù)防和治療性輸注血小板。然而目前的血液成分供應(yīng)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床所需。大量的研究表明體外利用干細(xì)胞制備血小板是一種可行的方式，這將為血小板的

2、臨床應(yīng)用獲得更多的來源。在血小板的形成過程中，有許多因素影響血小板的增殖、分化、成熟、釋放等，其中巨核細(xì)胞多倍體化的過程對于最終血小板的釋放量有著重要的意義。研究提示，多種小分子化合物能通過對細(xì)胞骨架的調(diào)控促進(jìn)巨核細(xì)胞多倍體化的形成。因此，我們的研究希望通過優(yōu)化小分子化合物的添加獲得更多多倍體的巨核細(xì)胞，為未來規(guī)模化的血小板制備提供新策略和技術(shù)支持。
　　方法:
　　首先建立了白血病細(xì)胞系向巨核細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系，使用低濃度

3、的佛波酯(PMA)對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并使用高濃度的PMA對其進(jìn)行多倍體化的誘導(dǎo);通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志及其細(xì)胞周期的變化，篩選出可獲得更多多倍體的誘導(dǎo)體系，并用于后續(xù)的研究。接下來分別將四種不同的小分子化合物尼克酰胺(NIC)、RHO-ROCK通路抑制劑(RRI)、Src通路抑制劑(SI)、Aurora-B通路抑制劑(ABI)單獨加入到細(xì)胞系誘導(dǎo)體系及臍帶血單個核細(xì)胞中，并再一步采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化，并對巨核細(xì)胞

4、特異性表面標(biāo)志進(jìn)行檢測，同時通過CCK-8及其細(xì)胞凋亡檢測進(jìn)一步分析細(xì)胞的增殖及凋亡情況，篩選出有利于細(xì)胞多倍體化，同時又不影響細(xì)胞凋亡的小分子化合物作為優(yōu)選的靶分子。進(jìn)一步檢測不同組合的小分子對多倍體形成的影響，并篩選優(yōu)化出最佳的小分子組合。最終，使用Q-PCR及其Western Blot技術(shù)對優(yōu)選的小分子組合及促進(jìn)白血病細(xì)胞系和造血祖細(xì)胞來源的巨核細(xì)胞多倍體化的機制進(jìn)行深入探討。
　　結(jié)果:
　　在優(yōu)化細(xì)胞系的培養(yǎng)中，采

5、用PMA(0.625ng/ml)進(jìn)行誘導(dǎo)分化3天，再采用PMA(10ng/ml)對細(xì)胞系進(jìn)行多倍體化誘導(dǎo)9天所形成的多倍體量達(dá)到15％以上，并與其它兩種方式具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。使用不同的四種小分子化合物后，在細(xì)胞系及臍帶血單個核細(xì)胞中均顯示SI和ABI兩種小分子可以明顯的促進(jìn)巨核細(xì)胞的多倍體化，并分別達(dá)到了29％以上，原代細(xì)胞中四倍體提高到14％，然而ABI對于原代細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，凋亡比例達(dá)到了70％，而SI在不影響細(xì)胞凋亡的情

6、況下，促進(jìn)多倍體的形成及特異性標(biāo)志CD61的表達(dá)，SI是優(yōu)選的小分子化合物。進(jìn)一步檢測其小分子組合的結(jié)果顯示，RRI+SI組合不僅可以提高細(xì)胞多倍體的形成，同時兩種小分子的加入促進(jìn)了向巨核系分化的特異性表面標(biāo)志的表達(dá)陽性率可提高54.65％，且不影響其細(xì)胞凋亡，從形態(tài)上也可以明顯地觀察到細(xì)胞多倍體。通過對組合小分子作用機制的探討，結(jié)果顯示SI和RRI可以降低p53及p21基因的表達(dá)，從而明顯地提高cyclin D1、cyclin E和c

7、yclin B1幾種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)了多倍體的形成。
　　結(jié)論:
　　體外制備血小板是未來重要的血小板來源，目前的研究表明可以通過小分子化合物的應(yīng)用促進(jìn)多倍體的形成，通過比較之間對多倍體的促進(jìn)作用并尋找更有效的小分子組合。從我們的實驗結(jié)果顯示，NIC促進(jìn)多倍體的形成效果并不明顯，同樣的也發(fā)現(xiàn)ABI盡管促進(jìn)多倍體化明顯，但是其凋亡作用使多倍體最終形成效率明顯的下降。我們的研究顯示RRI+SI的組合不管是加入到細(xì)胞系