色氨酸羥化酶-2在大腸桿菌中的表達及其畢赤酵母表達菌株的構(gòu)建.pdf

1、5-羥基色氨酸(5-HTP)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)的前體物,是腦部控制情緒、行為、睡眠、食欲的重要化學物質(zhì)。5-HTP不僅成功的應(yīng)用于抗抑郁、失眠的治療上,也可有效幫助產(chǎn)生飽足感,從而降低食欲,具有一定的減肥功效。
　　 色氨酸羥化酶-2(TPH-2)是5-HT合成過程中的限速酶,直接催化色氨酸生成5-HTP。本研究首次通過外源表達獲得了TPH-2蛋白,具有重要的學術(shù)價值并可能成為工業(yè)生產(chǎn)5-HTP的新

2、的重要途徑。
　　 本研究主要致力于來源于人的TPH-2基因在大腸桿菌表達體系中的表達及在畢赤酵母表達體系中表達載體的構(gòu)建整合。研究中構(gòu)建了原核表達載體pET32a-TPH、PGEX-4T-1-TPH和畢赤酵母表達載體pPICZα-TPH和pPIC3.5k-TPH,并分別在大腸桿菌BL21(DE3)表達體系和畢赤酵母表達體系中進行了重組蛋白表達的研究。在大腸桿菌表達體系中,通過兩個載體分別成功的首次表達出了具有his標簽的融合蛋

3、白和具有Gst標簽的融合蛋白。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中,也首次成功的將目的基因整合至畢赤酵母基因組中,構(gòu)建了穩(wěn)定的外源蛋白表達的工程菌。
　　 在微物轉(zhuǎn)化色氨酸生產(chǎn)5-HTP的研究中,篩選了40株霉菌、十余株放線菌及從加納籽中分離純化的未知菌株。首先通過分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法在微生物生長對數(shù)期添加底物進行底物轉(zhuǎn)化,同時為防止微生物自身代謝體系對底物色氨酸的利用,通過使用靜息細胞轉(zhuǎn)化的方法進行了微生物轉(zhuǎn)化,此種方法可以減少因微生物自身代謝而消

4、耗的色氨酸。即將培養(yǎng)后的微生物離心獲得菌體,將菌體分散在含有底物的生理鹽水中進行對底物的轉(zhuǎn)化。通過兩種微生物轉(zhuǎn)化色氨酸生成5-HTP方法的研究,初步探索了微生物轉(zhuǎn)化色氨酸生產(chǎn)5-HTP的能力,為后人開展生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)5-HTP奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了深入研究5-HTP的生理功能,開展了通過小鼠實驗驗證5-HTP抑制食欲,幫助減肥的功能的研究。通過與陽性對照和空白對照的比較,小鼠每天兩次,在喂食前一小時每次灌胃0.5mL濃度為0.1