家蠅14-3-3ζ基因的表達及抗菌功能初探.pdf

1、目的：
　　從家蠅cDNA文庫中篩選獲得家蠅14-3-3δ（MD14-3-3δ）基因序列，對該序列及其編碼蛋白進行分子特性分析，原核表達，初步探討重組蛋白的抗菌活性及抗菌機制；檢測MD14-3-3δ基因在家蠅生活史中各齡期及3齡幼蟲不同組織部位時空表達模式，初步探討經(jīng)大腸埃希菌誘導后，基因表達譜的變化，為進一步探討其功能提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、序列分析：采用生物信息學相關(guān)軟件，對家蠅14-3-3δ基因及其編

2、碼蛋白的基本理化性質(zhì)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)等進行分析，預測蛋白質(zhì)功能。2、cDNA克隆及原核表達：根據(jù)MD14-3-3δ的cDNA序列設(shè)計引物，PCR擴增，構(gòu)建pET-28a(+)-MD14-3-3δ重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物的可溶性，通過鎳柱純化重組蛋白。3、Western blot及質(zhì)譜鑒定：將純化的MD14-3-3δ蛋白免疫新西蘭大白兔，獲取多克隆抗體，Western b

3、lot鑒定重組蛋白；切下純化蛋白的SDS-PAGE條帶，送公司進行質(zhì)譜分析鑒定。4、重組MD14-3-3δ蛋白的抗菌活性檢測及抗菌功能初探：采用微量液體稀釋法，以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測重組蛋白的抗菌活性；細胞內(nèi)膜滲透性實驗檢測MD14-3-3δ對大腸埃希菌細胞膜通透性的影響。5、MD14-3-3δ基因時空表達模式的研究：1）收集家蠅生活史各發(fā)育階段（卵、各齡期、蛹、成蟲）的蟲體及3齡幼蟲不同組織（體壁、脂肪體、馬氏管、

4、中腸、唾液腺、氣管），分別提取總RNA后并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以家蠅RPS18為內(nèi)參基因，對不同樣本的MD14-3-3δ基因表達情況進行實時熒光定量PCR（qPCR）檢測，所有實驗進行3個生物重復，每個樣本重復實驗3次。2）大腸埃希菌誘導后MD14-3-3δ基因時空表達譜的變化：采用顯微注射的方法將細菌注入家蠅2齡晚期幼蟲，分別收集誘導后3h、6h、12h、24h、36h、48h蟲體，qPCR檢測不同時間點MD14-3-3δ基因表達水平的

5、變化，以注射PBS組為對照。
　　結(jié)果：
　　1、MD14-3-3δ基因ORF全長771 bp，編碼257個氨基酸，理論分子量29.35 kD；等電點4.87，屬于親水性的酸性蛋白，含有多種酶的結(jié)合位點，有14-3-3家族結(jié)構(gòu)域和活性位點，定位于細胞核中，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。2、成功構(gòu)建MD14-3-3δ原核表達載體，IPTG誘導后，上清可溶表達重組蛋白，經(jīng)鎳柱純化，獲得純化的MD14-3-3δ重組蛋白。3、W

6、estern blot結(jié)果顯示，得到與預計條帶大小相符的清晰條帶；質(zhì)譜分析顯示，重組蛋白序列與MD14-3-3δ序列一致。4、體外抗菌試驗結(jié)果：MD14-3-3δ蛋白對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，MIC(minimal inhibitory concentration)值分別為0.16 mg/mL、0.25 mg/mL。細胞內(nèi)膜滲透性實驗顯示，隨著MD14-3-3δ作用時間的延長，A430nm值從0.1左右上升至0.7，隨著

7、時間的延長而增加。5、時空表達模式研究：1）在不同發(fā)育時期，以卵期為參照，該基因在成蟲中表達量最高，表達量為成蟲>2齡幼蟲>蛹>1齡幼蟲>3齡幼蟲>卵，成蟲比卵期上調(diào)了141.773倍(P<0.05），2齡幼蟲則上調(diào)了79.7967倍(P<0.05)；在3齡幼蟲不同組織中，該基因在體壁表達量最高，其次為氣管（P<0.05）和唾液腺（P<0.01）。2）注射感染大腸埃希菌后,以PBS組為對照進行計算，表明注射感染大腸埃希菌后3 h，MD1

8、4-3-3δ基因出現(xiàn)明顯的上調(diào)，上調(diào)了14.704倍(P<0.05），其次為24 h，上調(diào)了2.503倍。36 h、48 h為下調(diào)趨勢(P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、本研究對家蠅14-3-3δ基因進行了分子特性分析，體外克隆、表達，獲得并鑒定了MD14-3-3δ重組蛋白；該重組蛋白在體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌均有抗菌效果，對大腸埃希菌抗菌活性較好；并能改變其細胞內(nèi)膜的通透性。2、MD14-3-3δ基因在家蠅不同