SIRT3在高血壓小鼠腎臟損害中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、論文Ⅰ:SIRT3對(duì)高血壓小鼠腎臟損害及足細(xì)胞損傷的影響
　　研究背景:
　　高血壓是慢性腎臟病的主要原因之一。高血壓腎損害，主要表現(xiàn)為蛋白尿、進(jìn)展的腎臟纖維化和炎癥，是高血壓的主要并發(fā)癥之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是高血壓腎臟損害的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因素，并且在慢性腎臟病的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。蛋白尿是高血壓腎臟損害的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且可以加重腎臟纖維化。大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellula

2、r matrix，ECM)的產(chǎn)生和累積導(dǎo)致了腎臟纖維化，從而造成了腎臟實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和腎臟功能的損害。腎臟纖維化的程度與高血壓腎臟病的預(yù)后息息相關(guān)。
　　足細(xì)胞，是一種終末分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞，位于腎小球?yàn)V過(guò)膜的最外層。足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)也是比較復(fù)雜的。由胞體以及向外伸展并相互交錯(cuò)的足突組成，在阻止蛋白尿的產(chǎn)生及維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障完整性上發(fā)揮了重要的作用。除此之外，足細(xì)胞的損傷可以引起促纖維化因子的

3、累積，從而導(dǎo)致腎臟纖維化和慢性腎臟病。纖連蛋白及Ⅳ型膠原是重要的纖維化因子，它們的減少可直接抑制甚至扭轉(zhuǎn)高血壓引起的腎臟損害。
　　SIRT3是NAD+依賴的去乙酰化酶家族成員之一，位于細(xì)胞內(nèi)的線粒體基質(zhì)，作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子參與了許多生物過(guò)程。SIRT3可以在翻譯后修飾過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)底物的去乙?；癄顟B(tài)而參與許多慢性疾病。近年來(lái)研究表明，SIRT3可以直接去乙?；疓SK3β，從而抑制TGFβ1信號(hào)通路，改善與老化相關(guān)的組織纖維

4、化。在腎臟中，已有報(bào)道表明，順鉑引起的急性腎臟損傷模型中，SIRT3起到了重要的保護(hù)作用。除此之外，在腎小管上皮細(xì)胞中，AngⅡ可以減少SIRT3mRNA的表達(dá)水平，這種作用可以被AngⅡ受體拮抗劑所阻斷。在腎臟足細(xì)胞中，尼可地爾可以增加SIRT3的表達(dá)。雖然SIRT3已被報(bào)道在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，但是SIRT3對(duì)高血壓引起的腎臟損害以及足細(xì)胞損傷的作用仍不清楚。
　　研究目的:
　　1.探討SIR

5、T3在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達(dá)變化;
　　2.探討SIRT3是否參與調(diào)節(jié)高血壓小鼠的腎臟損害過(guò)程;
　　3.探討SIRT3對(duì)高血壓引起的足細(xì)胞損傷的影響。
　　研究方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組: SIRT3-KO小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，基因背景為129S6/SvEvTac。8周齡雄性129野生型小鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物研究所。SIRT3過(guò)表達(dá)小鼠通過(guò)對(duì)129野生型小鼠進(jìn)行尾靜脈注射SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒

6、而獲得。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法(documentation No55，2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物90只隨機(jī)分為六組:正常對(duì)照組;AngⅡ組;SIRT3-/-+生理鹽水組;SIRT3-/-+AngⅡ組;SIRT3過(guò)表達(dá)+生理鹽水組;SIRT3過(guò)表達(dá)+AngⅡ組。
　　2.構(gòu)建小鼠高血壓模型:將預(yù)先灌滿適當(dāng)劑量血管緊張素Ⅱ的微量滲透泵分別埋入野生型小鼠、SIRT3-KO小

7、鼠、SIRT3過(guò)表達(dá)小鼠皮下，持續(xù)泵入AngⅡ42天，泵速為2000ng/Kg/min，造成高血壓小鼠模型，對(duì)照組泵入相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取材小鼠腎臟皮質(zhì)進(jìn)行研究。分別于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量小鼠血壓，留取小鼠尿液及血液進(jìn)行相關(guān)腎臟功能指標(biāo)檢測(cè)。
　　3.腎臟功能檢測(cè):將留取的血液及尿液離心后，取上清，分別用Elisa方法檢測(cè)尿蛋白及肌酐水平，血肌酐及尿素氮等腎臟功能指標(biāo)。
　　4.組織免疫染色:取材后，組織

8、切片分別進(jìn)行過(guò)碘酸-雪夫（periodic acid schiff, PAS）染色，觀察腎小球硬化情況;Masson染色，觀察腎臟間質(zhì)纖維化情況;免疫組織化學(xué)染色觀察纖維化相關(guān)分子的表達(dá)情況，并采用自動(dòng)圖像分析軟件(ImagePro Plus6.0)進(jìn)行定量分析。
　　5.透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu):腎臟取皮質(zhì)，用2.5％的戊二醛固定后，利用透射電子顯微鏡(TEM，H-7000FA，Hitachi，Tokyo，Japan)觀察腎小球

9、足突。
　　6.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:體外培養(yǎng)小鼠永生化足細(xì)胞系(MPC-5)。于5％ CO2、33°C培養(yǎng)箱增殖，5％ CO2、37°培養(yǎng)箱分化。分化成熟的足細(xì)胞進(jìn)行鑒定后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行SIRT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染等處理，給予體外培養(yǎng)的足細(xì)胞AngⅡ(10-6 M)刺激48h。
　　7.蛋白質(zhì)免疫印跡分析:腎臟皮質(zhì)組織或細(xì)胞用裂解液裂解后，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后孵育特異性一抗4°搖床

10、過(guò)夜，第二天孵育二抗后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，利用化學(xué)發(fā)光儀顯影目的蛋白，并用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。
　　8.免疫熒光染色:細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，Triton X-100打孔后，封閉30分鐘，滴加相應(yīng)濃度的一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS清洗一抗后，孵育FITC或TRITC標(biāo)記的二抗，經(jīng)DAPI染核后，封片拍攝。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用GraphPad Prism6軟件

11、進(jìn)行。兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用One-wayANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中SIRT3的表達(dá)水平下降
　　Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)的SIRT3水平明顯下降。組織免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，高血壓小鼠腎小球SIRT3表達(dá)明顯減弱。此結(jié)果提示，SIRT3的表達(dá)水平在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中降低。
　　2.SIRT

12、3調(diào)節(jié)了高血壓小鼠腎臟功能
　　我們檢測(cè)腎臟功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn):1.高血壓小鼠與正常對(duì)照組小鼠相比，腎臟功能指標(biāo)明顯升高，腎臟功能受損;2.SIRT3-KO高血壓小鼠比野生型高血壓小鼠的腎臟功能受損更加嚴(yán)重;3.SIRT3過(guò)表達(dá)后，腎臟功能損害程度明顯減輕。提示:SIRT3可能參與調(diào)節(jié)了高血壓小鼠的腎功能。
　　3.SIRT3參與調(diào)控高血壓小鼠腎臟纖維化
　　PAS及Masson染色顯示:高血壓小鼠腎臟發(fā)生了明顯的腎小球硬化

13、及間質(zhì)纖維化，并且這種變化在SIRT3-KO小鼠中更為嚴(yán)重;SIRT3過(guò)表達(dá)后，小鼠腎臟纖維化水平得到明顯改善。此外，我們檢測(cè)了腎臟皮質(zhì)中纖維化因子纖連蛋白及Ⅳ型膠原的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的纖維化因子水平升高，特別是在SIRT3-KO小鼠中升高更為明顯;SIRT3過(guò)表達(dá)后，纖維化因子的表達(dá)明顯下降。這些結(jié)果提示:SIRT3可能參與了高血壓小鼠腎臟纖維化的過(guò)程。
　　4.SIRT3介導(dǎo)了高血壓狀態(tài)下腎小球足細(xì)胞損傷的調(diào)控<

14、br>　　透射電鏡結(jié)果顯示，高血壓小鼠腎小球足突發(fā)生融合，SIRT3基因敲除后，這種融合更加嚴(yán)重，甚至發(fā)生斷裂，并且腎小球基底膜電子密度增高。值得注意的是，SIRT3過(guò)表達(dá)高血壓小鼠腎小球中，足突融合程度明顯減輕，腎小球基底膜電子密度正常。結(jié)果提示:SIRT3可能參與了高血壓小鼠腎小球足細(xì)胞損傷的調(diào)控。
　　5.足細(xì)胞中，SIRT3降低了AngⅡ引起的纖維化因子的表達(dá)
　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中，AngⅡ刺激引起

15、了SIRT3表達(dá)減少，纖連蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)升高，抑制SIRT3后，AngⅡ引起的纖維化因子的表達(dá)升高更為明顯。除此之外，僅在SRT3抑制后，與正常對(duì)照組相比，纖維化因子表達(dá)也增多，并且升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示:在腎臟足細(xì)胞中，SIRT3可能抑制了纖連蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT3在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達(dá)減少;
　　2.SIRT3參與調(diào)節(jié)高血壓小鼠的腎臟功能及腎臟纖維化;
　　3

16、.高血壓小鼠腎臟足細(xì)胞的損傷與足細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)下降有關(guān)。
　　論文Ⅱ:SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活對(duì)高血壓小鼠腎臟損害的影響
　　研究背景:
　　慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)是全球范圍的公共健康問(wèn)題。高血壓是導(dǎo)致慢性腎臟病的主要原因之一。高血壓腎損害的主要病理基礎(chǔ)是腎臟纖維化，其特征包括腎小球硬化和腎臟間質(zhì)的纖維化。引起腎臟纖維化的機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。

17、腎臟纖維化導(dǎo)致了腎臟功能的進(jìn)一步受損以及終末期腎臟疾病的發(fā)生。至今為止，除了透析和腎臟移植外，終末期腎臟病的治療手段還是非常缺乏并且多是無(wú)效的。因此，不斷提升對(duì)高血壓腎臟損害發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，對(duì)慢性腎臟病的預(yù)防及治療，發(fā)揮著極為重要的意義。
　　SIRT3是位于線粒體的Sirtuins家族成員之一，在代謝、氧化應(yīng)激等方面起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。SIRT3對(duì)疾病過(guò)程的調(diào)控，大多是通過(guò)直接調(diào)節(jié)其底物的去乙?；癄顟B(tài)，激活或抑制它們的活性

18、而實(shí)現(xiàn)的。目前SIRT3的底物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少。但SIRT3是如何調(diào)節(jié)高血壓腎臟損害的，具體分子機(jī)制至今尚未明確。KLF15是豐富表達(dá)于腎臟和肝臟的轉(zhuǎn)錄因子。KLF15可以通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的表達(dá)，減輕壓力負(fù)荷引起的心臟纖維化。在5/6腎臟切除的動(dòng)物模型中，KLF15改善了腎臟間質(zhì)纖維化。但KLF15與SIRT3的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　有研究表明，補(bǔ)充NAD或者使用AICA

19、R可以增加SIRT3的表達(dá)，保護(hù)器官免受損害。以增加SIRT3的表達(dá)及活性為目的的治療，極有可能會(huì)成為一種新的治療手段，但目前SIRT3的激活劑報(bào)道較少。和厚樸酚是從傳統(tǒng)中草藥中分離出的一種低分子多酚類化合物，具有多種藥理學(xué)活性，比如抗炎、抗氧化、抗血管生成以及抗癌。有研究表明，和厚樸酚可以通過(guò)激活SIRT3，從而抑制心肌肥厚。此外，在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral uretereal obstruction，UUO)模型中，和厚

20、樸酚可以減輕腎小管的損傷，并抑制腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生。在腎臟細(xì)胞中，和厚樸酚抑制了TGF-β1引起的促纖維化因子的產(chǎn)生和ECM的累積。因此，本實(shí)驗(yàn)我們將探討小鼠腎臟皮質(zhì)中和厚樸酚對(duì)SIRT3的作用，以及SIRT3的激活對(duì)高血壓腎損害的影響及可能的分子機(jī)制，為高血壓腎臟損害的治療提供新靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　1.探討SIRT3參與調(diào)控高血壓腎損害的潛在分子機(jī)制;
　　2.探討小鼠腎臟皮質(zhì)和足細(xì)胞中和厚樸酚對(duì)SIRT3

21、的影響;
　　3.探討SIRT3的激活對(duì)高血壓腎損害的作用。
　　研究方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:129野生型小鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物研究所。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)家衛(wèi)生部動(dòng)物管理辦法(documentation No55，2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只隨機(jī)分為四組:正常對(duì)照組;AngⅡ組;SIRT3激活組;SIRT3激活+AngⅡ組。
　　2.構(gòu)建動(dòng)物模型:給予129

22、野生型小鼠腹腔注射和厚樸酚（25mg/Kg/天），構(gòu)建SIRT3激活組。皮下埋置AngⅡ微量滲透泵，持續(xù)泵入AngⅡ42天，泵速為2000ng/Kg/min，造成高血壓小鼠模型，對(duì)照組泵入相同劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處以小鼠安樂(lè)死，取材小鼠腎臟皮質(zhì)進(jìn)行纖維化等研究。并分別于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量小鼠血壓，留取小鼠尿液及血液進(jìn)行相關(guān)腎臟功能指標(biāo)檢測(cè)。
　　3.腎臟功能檢測(cè):留取血液及尿液離心后取上清，分別用Elisa方法檢測(cè)尿蛋白

23、及肌酐水平，血肌酐及尿素氮水平，評(píng)估各組小鼠腎臟功能。
　　4.組織免疫染色:取材后，組織切片分別進(jìn)行過(guò)碘酸-雪夫(PAS)染色，觀察腎小球硬化情況;Masson染色，觀察腎臟間質(zhì)纖維化;對(duì)相關(guān)纖維化相關(guān)分子進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并采用自動(dòng)圖像分析軟件(Image Pro Plus)進(jìn)行定量分析。
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:體外培養(yǎng)的小鼠永生化足細(xì)胞系（MPC-5），于5％ CO2、33℃培養(yǎng)箱增殖，5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱

24、分化。分化成熟的足細(xì)胞進(jìn)行SIRT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染及AngⅡ刺激，和厚樸酚干預(yù)等處理，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　6.蛋白質(zhì)免疫印跡分析:提取腎臟皮質(zhì)組織或細(xì)胞蛋白，然后進(jìn)行電泳。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉1h后，孵育特異性一抗4℃過(guò)夜，第二天孵育二抗，然后利用化學(xué)發(fā)光儀和ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶。
　　7.免疫沉淀反應(yīng):制備蛋白樣品后，去除非特異性結(jié)合，然后利用相應(yīng)的抗體，進(jìn)行免疫沉淀，并用蛋白免

25、疫印跡技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
　　8.免疫熒光:細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后用4％多聚甲醛固定，經(jīng)Triton X-100打孔、封閉后，滴加相應(yīng)稀釋濃度的一抗，4℃孵育過(guò)夜。第二天清洗一抗，并孵育FITC或TRITC標(biāo)記的二抗，經(jīng)DAPI染核后，封片拍攝。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行。兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用One-wayANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05

26、被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.SIRT3通過(guò)去乙酰化KLF15，激活了KLF15的抗纖維化作用
　　KLF15是腎臟富集的一個(gè)抗纖維化因子，在足細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)SIRT3可以和KLF15共定位并相互結(jié)合，抑制SIRT3表達(dá)后，KLF15的乙?；矫黠@升高。給予足細(xì)胞AngⅡ刺激后，SIRT3與KLF15的結(jié)合能力及KLF15的去乙?；骄鶞p弱。此外，抑制KLF15的表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)纖維化因子纖連蛋白和

27、Ⅳ型膠原升高。提示:在足細(xì)胞中，SIRT3可能通過(guò)去乙酰化KLF15而激活它的抗纖維化作用。
　　2.和厚樸酚增加了足細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)水平
　　Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予足細(xì)胞和厚樸酚干預(yù)，SIRT3表達(dá)升高。而且經(jīng)和厚樸酚預(yù)處理后給予AngⅡ刺激，SIRT3表達(dá)高于AngⅡ刺激組。此結(jié)果提示，在腎臟足細(xì)胞中，和厚樸酚可以增加SIRT3的表達(dá)水平。
　　3.SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活，抑制了

28、足細(xì)胞中AngⅡ引起的纖維化變化
　　為了進(jìn)一步探討和厚樸酚對(duì)SIRT3-KLF15信號(hào)通路的影響，我們探究了足細(xì)胞中和厚樸酚干預(yù)后，KLF15的表達(dá)水平以及KLF15的去乙?；癄顟B(tài)，發(fā)現(xiàn)，給予和厚樸酚干預(yù)后，足細(xì)胞中KLF15的表達(dá)及其去乙酰化水平均增加，并且AngⅡ引起的纖連蛋白與Ⅳ型膠原的表達(dá)減少，提示:和厚樸酚可能激活了SIRT3-KLF15信號(hào)通路，抑制了AngⅡ引起的纖維化因子的表達(dá)。
　　4.SIRT3-KLF

29、15信號(hào)通路的激活改善了高血壓小鼠腎臟功能
　　我們檢測(cè)小鼠尿肌酐和尿白蛋白，小鼠血液肌酐和尿素氮水平。發(fā)現(xiàn):給予和厚樸酚治療后，高血壓小鼠腎臟功能明顯改善。提示:SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活可能對(duì)高血壓小鼠的腎功能起到一定的保護(hù)作用。
　　5.SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活減輕了高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化
　　我們檢測(cè)了SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活對(duì)高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的影響，

30、結(jié)果顯示:給予和厚樸酚治療的高血壓小鼠，腎小球硬化程度明顯減輕，膠原纖維明顯減少，腎臟間質(zhì)纖維化得到明顯改善。說(shuō)明SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活可能抑制了高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。
　　6.SIRT3-KLF15信號(hào)通路的激活降低了高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中纖維化因子的表達(dá)
　　我們檢測(cè)腎臟皮質(zhì)中相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，給予和厚樸酚治療后，腎臟皮質(zhì)中SIRT3的表達(dá)升高，纖連蛋白和 V型膠原的表達(dá)明顯下降。結(jié)果提示:SI