基于微流控芯片的膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲.pdf

1、目的:
　　借助全新膀胱癌特異性單克隆抗體BCMab1、生物素-親和素系統(tǒng)及微流控芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)并制作膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性篩選芯片，實(shí)現(xiàn)對(duì)膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲，并探討影響芯片捕獲靶細(xì)胞的因素。
　　方法:
　　1.篩選芯片的設(shè)計(jì):借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選芯片。整個(gè)篩選芯片由上下兩部分組成，且每部分均有微結(jié)構(gòu)，上部分為魚骨結(jié)構(gòu)，用于改變流體性狀，下部分為微通道結(jié)構(gòu)，用于捕獲靶細(xì)胞。
　　2.篩選

2、芯片的制作:制作硅片模板、用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作基片、修剪、打孔、清洗處理，等離子處理鍵合封接上下兩部分，制成篩選芯片。
　　3.篩選芯片的表面修飾:首先，將鏈霉親和素包被到微通道內(nèi);其次，對(duì)膀胱癌單克隆抗體BCMab1進(jìn)行生物素化修飾;最后，將生物素化的抗體灌入微通道內(nèi)，鏈霉親和素與生物素化抗體結(jié)合，最終形成鏈霉親和素-生物素-抗體系統(tǒng)。
　　4.樣本液的制備:取膀胱癌細(xì)胞T24作為靶細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前用熒光染料5(6

3、)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)按說明對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。取得實(shí)驗(yàn)參與者知情同意，取健康人外周血，用生理鹽水稀釋10倍。將標(biāo)記的膀胱癌細(xì)胞T24加入到稀釋10倍的人外周血液中，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要制備不同細(xì)胞濃度的樣本液。
　　5。芯片的設(shè)計(jì)分組:在實(shí)驗(yàn)中，為了研究抗體對(duì)靶細(xì)胞是否具有捕獲作用，根據(jù)芯片表面抗體包被情況，將芯片制作成兩種:有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMab1抗體的芯片;有魚骨結(jié)構(gòu)無BCMab1抗體的芯片。

4、　　6.芯片捕獲靶細(xì)胞:將60μ l、靶細(xì)胞濃度為5000個(gè)/ml的樣本液以流速為10μl/min分別泵入到有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMab1抗體的芯片和有魚骨結(jié)構(gòu)無BCMab1抗體的兩組芯片中，沖洗后，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)捕獲率。
　　7.探討影響芯片捕獲靶細(xì)胞的因素:①為了探討流速對(duì)芯片捕獲率的影響，將60μl、濃度為5000個(gè)/ml的樣本液分別以流速為10、15、20、25和30μ l/min泵入到含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片中;②

5、為了探討細(xì)胞濃度對(duì)芯片捕獲率的影響，將細(xì)胞濃度為500、5000和50000個(gè)/ml的樣本液，以10μ l/min的速度泵入到含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片通道內(nèi)進(jìn)行篩選;③為研究魚骨結(jié)構(gòu)對(duì)芯片捕獲靶細(xì)胞的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種不同的芯片，即含有魚骨結(jié)構(gòu)和未含有魚骨結(jié)構(gòu)的芯片，二者均包被BCMab1抗體，將60μl細(xì)胞濃度為5000個(gè)/ml的樣本液，借助注射泵，以流速為10μ l/min分別泵入到有魚骨結(jié)構(gòu)及BCMab1抗體的芯片和無魚骨結(jié)構(gòu)有

6、BCMab1抗體的芯片，沖洗后，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.制作成特異性篩選膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片，大小為40mm×5mm×3mm。芯片上下兩層，上層為魚骨樣結(jié)構(gòu)，寬50μm，高45μm，相鄰兩個(gè)魚骨結(jié)構(gòu)之間的間距為100～300μ m;下層為微通道，微通道高為50μm。
　　2.高倍顯微鏡下觀察到，含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片對(duì)膀胱癌細(xì)胞T4具有明顯的捕獲作用。包被有BCMab1抗體的芯片對(duì)靶細(xì)胞

7、捕獲平均(20.8±6.3)個(gè)，未含抗體的芯片對(duì)靶細(xì)胞捕獲為平均(1.2±1.1)個(gè)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.在不同細(xì)胞濃度下，芯片對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率維持在89％左右。隨著流速的增加芯片對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率下降;當(dāng)流速在10μ l/min時(shí)，無論是含有魚骨結(jié)構(gòu)的篩選芯片還是不含魚骨結(jié)構(gòu)的篩選芯片，對(duì)靶細(xì)胞的捕獲率最大。在同一流速下，含有抗體及魚骨結(jié)構(gòu)的芯片捕獲率明顯高于含有抗體而未含有魚骨結(jié)構(gòu)的芯片捕獲率為(P＜