紡錘體與動(dòng)粒相關(guān)蛋白-1在唾液腺腺樣囊性癌中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)，亦稱(chēng)涎腺腺樣囊性癌，是頭頸部一個(gè)重要的上皮源性惡性腫瘤，約占唾液腺惡性腫瘤的21-24％以及頭頸部惡性腫瘤的1％左右。本病病程雖然進(jìn)展緩慢但局部侵襲能力很強(qiáng)、血行性轉(zhuǎn)移率高，容易侵犯周?chē)窠?jīng)和脈管，具有較高的復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，尤其是易轉(zhuǎn)移至肺部、骨及肝臟，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率可高達(dá)40％，被描述為頭頸部最具有破壞性及最難以預(yù)

2、測(cè)的腫瘤之一。雖然目前手術(shù)完全切除和輔助化療已被證明可改善患者的長(zhǎng)期生存率，但腺樣囊性癌的預(yù)后仍然較差，局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍時(shí)有發(fā)生，即使是經(jīng)過(guò)了根治性的手術(shù)切除及綜合序列治療后，或是原發(fā)部位已經(jīng)得到良好控制后。腺樣囊性癌的惡性增殖、轉(zhuǎn)移對(duì)其復(fù)發(fā)具有重要影響，因此，尋找控制腺樣囊性癌增殖的作用靶點(diǎn)，對(duì)其治療、預(yù)后具有重要意義，而有絲分裂是真核細(xì)胞主要的增殖方式。
　　有絲分裂異常是大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的共同特征。紡錘體和動(dòng)粒相關(guān)蛋白

3、復(fù)合體亞基-1，或稱(chēng)為紡錘體與動(dòng)粒相關(guān)蛋白-1(the spindle andkinetochore-associated complex subunit1，SKA1)的是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的與有絲分裂相關(guān)的基因。SKA1蛋白定位于有絲分裂期間紡錘絲和外動(dòng)粒界面，參與構(gòu)成的紡錘體與動(dòng)粒相關(guān)蛋白復(fù)合體(spindle and kinetochore associated complex，SKA復(fù)合體)，是有絲分裂期間動(dòng)粒與微管形成穩(wěn)定結(jié)合所必需

4、的組成部分。SKA復(fù)合體具有許多重要的功能，其能夠調(diào)節(jié)微管的解聚，從而牽動(dòng)姐妹染色單體的極向移動(dòng)，確保有絲分裂的順利完成。SKA復(fù)合體還具有沉默紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的功能，SKA復(fù)合體或其成員的損耗能夠?qū)е氯旧w排列不整齊或排列延遲，從而使檢測(cè)點(diǎn)依賴的有絲分裂阻滯于分裂中期。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)小分子RNA干擾的方式減少SKA1的表達(dá)后，雖然不會(huì)明顯改變著絲粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，但會(huì)導(dǎo)致微管連結(jié)缺陷及染色體中期板集合延遲，引起嚴(yán)重的染色體分離缺陷?？梢?jiàn)，S

5、KA1及SKA復(fù)合體是確保有絲分裂順利完成的關(guān)鍵組件，在真核細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　目前的研究表明SKA1與肝細(xì)胞癌、胃癌、膀胱癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌以及前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。采用RNA干擾技術(shù)沉默SKA1基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)上述惡性腫瘤的細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力均明顯下降，多數(shù)腫瘤的細(xì)胞周期也發(fā)生明顯變化。多變量生存分析發(fā)現(xiàn)SKA1高表達(dá)是甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)無(wú)瘤生存及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)瘤生

6、存的獨(dú)立預(yù)后因素。也有研究發(fā)現(xiàn)，SKA1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與p21、ERK2、Bcl-2、Bax和磷酸化Akt等多個(gè)因子的表達(dá)相關(guān)。此外，SKA1與化療藥物順鉑的耐藥也密切相關(guān)。上述研究表明，SKA1可能是通過(guò)多種機(jī)制影響腫瘤的惡性增殖及發(fā)生發(fā)展。提示SKA1基因有望成為一種新的腫瘤預(yù)后標(biāo)志分子或腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行RNA干涉，有可能成為腫瘤基因治療的有效手段。目前，有關(guān)SKA1在頭頸部腺樣囊性癌中的相關(guān)作用尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研

7、究擬通過(guò)檢測(cè)SKA1蛋白在頭頸部腺樣囊性癌組織中的表達(dá)，分析其與腺樣囊性癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性;并進(jìn)一步探討SKA1在腺樣囊性癌細(xì)胞惡性增殖、細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移侵襲中的分子機(jī)制，以期為臨床治療及預(yù)后判斷提供具有參考價(jià)值的科學(xué)理論依據(jù)。
　　第一部分:SKA1在頭頸部腺樣囊性癌中的表達(dá)及臨床意義的研究
　　研究目的:檢測(cè)SKA1在頭頸部腺樣囊性癌組織中的表達(dá)，分析SKA1表達(dá)的臨床意義。
　　研究方法:
　　1.

8、病例選擇:本研究選取了聊城市人民醫(yī)院2005年至2013年期間42例頭頸部腺樣囊性癌的石蠟包埋組織（其中40例納入隨訪研究）。同時(shí)收集20例癌旁組織作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放射治療、化療、激素治療以及其他任何抗腫瘤治療。經(jīng)兩名不知曉臨床病理資料的病理醫(yī)師確診為腺樣囊性癌的樣本納入研究。
　　2.免疫組化評(píng)估SKA1蛋白的表達(dá):采用免疫組織化學(xué)SV(Super Vision)法判斷ACC腫瘤組織組及癌旁正常組織組中SKA1蛋

9、白的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果按照陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比以及著色的深淺強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行綜合判斷。1）按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類(lèi)細(xì)胞數(shù)的百分比，可分為四組:①位于0-5％之間，為0分;②位于6-20％之間，為1分;③位于20-60％之間，為2分;④位于60-100％之間，為3分。2）按照陽(yáng)性細(xì)胞的著色程度來(lái)判定評(píng)分:①細(xì)胞呈淺黃色顯色為0分;②細(xì)胞著色黃色為1分;③細(xì)胞著色為棕黃色定為2分;④細(xì)胞著色為紅褐色記為3分?？傮w評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分×

10、細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分，將0-1分定為陰性（-）;2-4分計(jì)為陽(yáng)性(+);＞4分計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性(++)
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各臨床變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)，病例數(shù)n≤1者采用Fisher確切概率法，以(P＜0.05)為具有顯著性差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.SKA1在腺樣囊性癌組織中的表達(dá)分布
　　SKA1在腺樣囊性癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，包括

11、導(dǎo)管細(xì)胞和變異肌上皮細(xì)胞，而腫瘤間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯著色。SKA1在腺樣囊性癌癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿及/或胞核中的黃色或棕黃色顆粒沉淀。大部分陽(yáng)性病例表現(xiàn)為胞核及胞漿均有著色，但細(xì)胞核著色強(qiáng)度更明顯;個(gè)別病例則表現(xiàn)為僅胞漿存在著色。SKA1在腺樣囊性癌組織中的表達(dá)明顯高于其在癌旁正常組織中的表達(dá)，組間比較具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.SKA1的表達(dá)與腺樣囊性癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系
　　臨床資料統(tǒng)計(jì)分析表明，S

12、KA1的表達(dá)在腺樣囊性癌TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.05)，在SACC實(shí)性型中的表達(dá)水平明顯高于篩孔狀/管狀型(P＜0.05)。SKA1的表達(dá)與患者性別、年齡、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)神經(jīng)侵襲以及患者5年生存率無(wú)明顯相關(guān)，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40例患者的5年生存率為52.5％。
　　結(jié)論:
　　SACC腫瘤組中高表達(dá)SKA1蛋白，且在晚期患者及實(shí)性組織病理類(lèi)型中表達(dá)明顯增高，檢測(cè)SKA1的表達(dá)有助

13、于頭頸部腺樣囊性癌的診斷、治療和預(yù)后判斷。
　　第二部分:SKA1調(diào)控涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞SACC-83增殖與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　研究目的:驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)的shSKA1是否能有效沉默涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞SKA1基因的表達(dá)，探討SKA1調(diào)節(jié)頭頸部腺樣囊性癌惡性增殖及轉(zhuǎn)移侵襲的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.慢病毒感染及感染效率評(píng)估:涎腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞被分為三組:Con組（空白對(duì)照細(xì)胞）、Lv-shCo

14、n組（陰性對(duì)照組/無(wú)義序列慢病毒感染的細(xì)胞組）和Lv-shSKA1組（靶向SKA1的慢病毒感染細(xì)胞組）。按照MOI=10，分別加入Lv-shSKA1慢病毒和Lv-shCon陰性對(duì)照慢病毒。感染3天，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，評(píng)估慢病毒對(duì)于腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞的感染效率。
　　2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)SKA1 mRNA的表達(dá):按說(shuō)明Trizol1 ml提取

15、總RNA，紫外分光光度法測(cè)定260 nm和280 nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的光吸收，計(jì)算RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參基因行PCR反應(yīng)，按照2-ΔΔCt法取RQ值(RQ=2-ΔΔCt)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。
　　3.Western blot檢測(cè)SKA1沉默后相關(guān)蛋白的表達(dá):收集各組SACC細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞融合率達(dá)到80％以上，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白提取，以及樣品蛋白濃度測(cè)定。SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS

16、-PAGE電泳)、轉(zhuǎn)膜、加入一抗及二抗，按照ECL蛋白印跡顯色試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖: MTT法檢測(cè)SKA1基因沉默后對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞增殖的影響，酶標(biāo)儀測(cè)定595nm處的吸光值(OD595nm)，以時(shí)間為橫軸(X軸)，光吸收值為縱軸（Y軸），繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　5.流式細(xì)胞儀(FIow cytometry, FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期:收集慢病毒感染的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組SACC細(xì)胞，

17、按要求處理后PI（碘化丙啶）染色，過(guò)濾，上機(jī)，檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。
　　6.細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組SACC細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種到24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞單層融合，劃痕，無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后測(cè)量劃痕距離。
　　7.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell小室）檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:按要求處理各組細(xì)胞后接種到已鋪膠的Transwell小室，常

18、規(guī)培養(yǎng)24 h后甲醇固定，0.1％結(jié)晶紫染色貼附在膜下室面的細(xì)胞，計(jì)數(shù)隨機(jī)選取的5個(gè)高倍視野(40×)內(nèi)的細(xì)胞。
　　研究結(jié)果:
　　1.免疫熒光顯微鏡下GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示無(wú)義序列慢病毒感染的細(xì)胞組（Lv-shCon組）和目的基因RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染的細(xì)胞組(Lv-shSKA1組)的感染效率均高于80％。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Lv-shSKA1組中SKA1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯

19、著低于Lv-shCon組。
　　2.免疫印跡結(jié)果顯示，沉默SKA1的表達(dá)后與腺樣囊性癌細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的各種蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)。表現(xiàn)為p27蛋白的表達(dá)上調(diào)，CDK4、CyclinD1， Cyclin E1， Cyclin B1及Ndc80蛋白的表達(dá)下降;E-cadherin表達(dá)上升而N-cadherin和MMP-9表達(dá)下調(diào)。
　　3.MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照慢病毒感染組相比，腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞

20、的Lv-shSKA1慢病毒感染組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)顯示，SKA1基因被沉默后，SACC-83細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S期。
　　5.細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Lv-shSKA1慢病毒感染組細(xì)胞遷移距離明顯小于未轉(zhuǎn)染組SACC-83細(xì)胞和Lv-shCon組細(xì)胞。
　　6.Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lv-shSKA1慢病毒感染組的細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠貼附在膜下室面的細(xì)胞數(shù)明

21、顯少于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照病毒感染組。
　　結(jié)論:
　　1.敲減SKA1基因在頭頸部腺樣囊性癌中的表達(dá)，可使細(xì)胞周期細(xì)胞周期阻滯于S期，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　2.SKA1基因沉默可下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因Ndc80，CDK4，Cyclin D1，CyclinE1，Cyclin B1的表達(dá)而促進(jìn)p27蛋白的表達(dá)，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　3.敲減SKA1基因可促進(jìn)E-cadherin但抑制N-cad