骨髓間充質干細胞體外分化為雄性生殖細胞樣細胞的改良誘導法.pdf

1、第一部分：建立大鼠骨髓間充質干細胞體外分離、培養(yǎng)與鑒定的穩(wěn)定體系
　　目的:根據大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)的生物學特性和生長環(huán)境,選取兩種體外分離骨髓間充質干細胞的方法對SD大鼠進行骨髓間充質干細胞培養(yǎng),分析比較兩種方法獲取的骨髓間充質干細胞的純度、數量和功能,為本研究建立穩(wěn)定的大鼠骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)條件。
　　方法:通過全骨髓培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法,以5周齡SPF級SD大鼠為實驗動物,體外分離純化rBM

2、SCs,對原代到第五代(P5)細胞進行生長密度的記錄進而繪制生長曲線;通過MTT實驗和臺盼藍拒染實驗比較兩種培養(yǎng)方法的效率;通過成骨和成脂誘導來鑒定rBMSCs的分化能力來確定所培養(yǎng)細胞的分化潛能。
　　結果:rBMSCs大約5天形成成纖維細胞樣集落,14天融合至80％-90%,第一代細胞(P1)至第五代細胞(P5)生長過程中,每生長約5天即可傳代,細胞生長曲線呈“S”型,rBMSCs可定向分化為成骨細胞和成脂細胞,全骨髓培養(yǎng)法獲

3、得的第三代骨髓間充質干細胞(P3)生長能力較強,誘導效率高。
　　結論:通過全骨髓培養(yǎng)法體外獲得的rBMSCs生長活力高并且細胞分化能力強,可作為后期骨髓間充質干細胞的穩(wěn)定培養(yǎng)方案。
　　第二部分：改良誘導法體外誘導rBMSCs分化為雄性生殖細胞樣細胞
　　目的:通過體外誘導rBMSCs分化成為雄性生殖細胞樣細胞,比較傳統生殖細胞誘導法和改良生殖細胞誘導法的差別,從而優(yōu)化骨髓間充質干細胞體外定向分化為雄性生殖細胞樣細胞

4、的條件。
　　方法:結合現有的誘導方法的優(yōu)點和缺點,用單純的全反式維甲酸誘導液誘導細胞3天后換為改良的FSH、LH和T誘導液誘導rBMSCs至7天、14天和21天,選取Stra8、Ddx4(Vasa)等作為不同時期雄性生殖細胞的標志物進行RT-qPCR檢測,分析其mRNA的表達量差異。通過Westernblot和免疫熒光染色法檢測誘導的細胞表達雄性生殖細胞特異性標志STRA8和VASA的蛋白水平。
　　結果:RT-qPCR檢

5、測結果顯示改良誘導法誘導后的細胞Stra8、Ddx4和Tex14三種mRNA表達量均高于傳統誘導法的表達量。Westernblot檢測到兩種誘導方法誘導后的rBMSCs均表達STRA8、VASA,但傳統誘導法誘導rBMSCs后的STRA8和VASA4兩種蛋白的表達量低于改良誘導法的表達量。
　　結論:骨髓間充質干細胞在體外可通過兩種不同的方法誘導為雄性生殖細胞樣細胞,而改良誘導法的誘導效率高于傳統的生殖細胞誘導法。
　　第三

6、部分：體外誘導的雄性生殖細胞樣細胞(mGCLCs)體內移植實驗
　　目的:將改良誘導法誘導大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)生成的mGCLCs移植入無精子癥大鼠模型的睪丸內,觀察細胞的生長能力及評價無精癥動物模型的生殖功能。
　　方法:50mg/kg環(huán)磷酰胺通過腹腔注入大鼠體內建無精子癥模型,然后將10μl誘導后的雄性生殖細胞樣細胞通過DAPI標記經睪丸輸出小管移植入無精子癥大鼠,陰性對照組將同等劑量的生理鹽水注射入無精子