卡維地洛對糖尿病心肌病的心肌保護作用及其機制研究.pdf

1、近年來，糖尿病的發(fā)病率明顯上升，糖尿病心肌?。╠iab eticcardiomyopathy,DCM）作為一個獨立于冠心病、心臟瓣膜病、高血壓病性心臟病的臨床疾病，主要表現(xiàn)為心肌收縮和舒張功能異常。目前DCM的發(fā)病機制較為復雜，主要與心肌能量代謝紊亂、炎癥、氧化應激、鈣離子超載、細胞凋亡有關，而其主要的病理表現(xiàn)為心肌細胞肥大、細胞外基質沉積、心室質量/體質量（心重指數(shù)）增加、心肌間質重構及心肌纖維化。Firodaliso等研究表明，鏈脲

2、佐菌素（Streptozotocin,STZ）誘導的糖尿病大鼠早期（3天）即可出現(xiàn)心肌細胞凋亡現(xiàn)象，因此認為氧化應激、心肌細胞凋亡、心肌纖維化可能在DCM心室重塑及心力衰竭中起著十分重要的作用。和細胞增殖一樣，細胞凋亡也是受基因調控的精確過程。目前細胞凋亡的途徑主要有兩條，一是通過細胞膜上的死亡受體激活天冬氨酸蛋白水解酶（cys teinylasp artate spec ificp ro teinase,casp ase），而另一條途

3、徑是通過細胞質內的線粒體途徑釋放細胞因子，細胞因子可激活caspase，降解細胞內的重要蛋白質，從而誘導細胞凋亡。因此，caspase-3作為細胞凋亡的標志物，在各種因素啟動的凋亡程序中發(fā)揮著關鍵的調控作用，是參與凋亡的caspase級聯(lián)反應的最終效應因子，抑制caspase-3的活性或功能可抑制細胞凋亡。
　　AKT也稱蛋白激酶B（protein kinaseB,PKB），可誘導相關轉錄因子的磷酸化，通過上調抗凋亡基因和下調凋亡

4、基因的表達，從而實現(xiàn)對細胞凋亡的抑制，促進細胞存活。在新發(fā)現(xiàn)的抗凋亡蛋白家族中，X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitorof apoptosis protein,XIAP）蛋白是目前已知最強的凋亡抑制因子，可直接抑制casp ase從而的保護細胞免受各種凋亡刺激。而AKT能夠磷酸化XIAP的Ser87位點，使其免于被泛素化及降解，穩(wěn)定在細胞內的表達，起到抑制凋亡作用。
　　銜接蛋白p66s hc可參與細胞內氧化應激

5、信號的轉導，調控細胞內線粒體活性氧ROS的產生并介導細胞凋亡。諸多研究表明，p66s hc參與了心血管疾病、糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展。另外，p66s hc的磷酸化是由體內PKCβ的激活調節(jié)的。PKCβ/p66shc信號通路參與小腸缺血再灌注損傷介導的多臟器損傷的病理生理過程。
　　卡維地洛作為第三代?-受體阻滯劑，既能阻滯β1、β2受體，還能阻滯α1受體，同時具有抗氧化、清除氧自由基、減輕心室重構、抑制心肌纖維化、抑制細胞凋亡的作

6、用?？ňS地洛對糖尿病心肌病患者可能具有保護作用，其具體機制尚未完全闡明，可能與細胞內多個信號轉導通路有關。為證明該假設，本研究:
　　1）臨床觀察卡維地洛對糖尿病心肌病患者的療效；
　　2）應用糖尿病心肌病大鼠動物模型，和體外高糖誘導的H9C2心肌細胞模型，觀察卡維地洛對心肌炎癥反應、細胞凋亡、膠原代謝、AKT/XIAP信號通路及PKCβ/p66s hc線粒體氧化應激信號通路等的影響，為治療糖尿病心肌病提供新的理論基礎和實驗

7、依據(jù)。
　　第一部分：卡維地洛對糖尿病心肌病患者代謝、炎癥反應及心功能的影響
　　目的：
　　卡維地洛對糖尿病心肌病患者心功能的影響及機制
　　方法：
　　選擇2014年9月至2016年9月于唐山市工人醫(yī)院心內科及內分泌科收治的糖尿病心肌病患者共90例，均符合診斷標準，其中男性50例，女性40例，年齡35-65歲，平均年齡45.6歲，采用簡單隨機化方法隨機分為卡維地洛治療組（n=50例）和對照組（n=40例

8、）。對照組采用常規(guī)治療，卡維地洛治療組在對照組用藥的基礎上加用卡維地洛（達力全，羅氏制藥）3.125 mg2/日口服2周，2周后如果無明顯的心衰加重表現(xiàn)，改為6.25 mg2/日口服，繼續(xù)口服2周，如仍無心衰加重表現(xiàn)，再繼續(xù)口服8周。兩組在開始治療前及治療后12周，應用ELISA法分別檢測血清hsCRP、TNF-α、NT-proBNP(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,氨基末端B型腦鈉肽

9、前體)、空腹血糖、總膽固醇及甘油三酯水平，應用心臟超聲檢測左室舒張末期（LVEDd）及收縮末期內徑（LVEDs）、左室射血分數(shù)（LVEF），通過6分鐘步行距離實驗來評定患者的運動耐力。
　　結果：
　　1.生化指標的改變：兩組治療前后相比：空腹血糖、總膽固醇及甘油三酯水平無顯著差異（P>0.05），且卡維地洛治療12周后，治療組與對照組相比上述生化指標仍無顯著差異（P>0.05）。
　　2.心臟功能的變化：兩組治療后左

10、室舒張末期內徑、收縮末期內徑、NT-proBNP水平均較治療前明顯減低（P<0.05），且治療組與對照組相比減低更顯著（P<0.05）；兩組左室射血分數(shù)均較治療前顯著升高（P<0.05），且治療組與對照組相比升高更明顯（P<0.05）?？ňS地洛治療組6分鐘步行距離（577.40±80.13）m,較治療前（292.95±34.12）m有所改善（P<0.05），與對照組（456.32±30.09） m相比有顯著差異（P<0.05），對照組自

11、身治療前后對比6分鐘步行距離也有顯著差異（296.68±21.79）mvs（456.32±30.09）m（P<0.05）。
　　3.炎癥指標的改變：兩組治療前后相比血清hsCRP、TNF-α水平明顯減低（p<0.05），且治療組與對照組相比減低更顯著（P<0.05）；
　　結論：
　　卡維地洛應用于糖尿病心肌病患者可以顯著改善患者心臟收縮與舒張功能，提高患者的活動耐量，不影響患者血糖及血脂水平，其治療作用可能與卡維地洛

12、能夠減輕心肌炎癥反應及氧化應激、抑制心室重構及細胞凋亡、減輕心肌纖維化有關；
　　第二部分：AKT/XIAP信號轉導通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病變中的表達及卡維地洛的干預研究
　　目的：
　　研究卡維地洛對糖尿病心肌病大鼠AKT/XIAP信號轉導通路的影響。
　　方法：
　　采用成年雄性Wistar SD大鼠，通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔內注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法，制成2型糖尿病心肌病大鼠模型。12周

13、后分成低劑量卡維地洛組（1mg/kg/d）、高劑量卡維地洛組（10mg/kg/d）,應用上述藥物每天給大鼠灌胃一次，健康對照組及模型組每天給予相同劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周后，處死取材。超聲心動圖檢測左室舒張末期內徑（LVEDd）、左室收縮末期內徑（LVEDs）、左室射血分數(shù)（LVEF）。通過應用光學顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察健康對照組、糖尿病組大鼠心臟的組織形態(tài)學改變，從而確定糖尿病心肌病模型建立情況以及心肌炎癥浸潤程度；通過

14、生化法檢測血清 IL-1β、TNF-ɑ、空腹血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）及NT-proBNP的含量以確定心肌的炎癥反應及代謝、心功能方面的改變；用T UNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況；用Mass o n及Viment in染色了解心肌纖維化情況；應用免疫組化方法檢測caspase-3的表達；應用Western bolt技術檢測AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、c asp as e-3及I型膠原蛋白(Co llgen

15、 I)的表達。
　　體外培養(yǎng)H9C2心肌細胞，分為正常對照組（NC，5.5mmol/LD-葡萄糖）,高糖組（HG,33mmol/LD-葡萄糖），高糖+卡維地洛組（HG+Carv,33mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L卡維地洛），應用Western bolt技術檢測AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、IL-1β、TNF-ɑ、Collgen I及caspase-3蛋白的表達。
　　結果：
　　1.大鼠的一般

16、情況比較：健康對照組（NC組）大鼠毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)、進食水情況及活動度均較好，糖尿病模型組（DM組）大鼠通過高糖高脂飲食的喂養(yǎng)體重明顯增加，喂養(yǎng)到4周時，體重已明顯高于對照組。4周時給予腹腔內一次性注射鏈脲佐菌素（STZ），給藥2周后，DM組大鼠體重開始下降，但在實驗結束時仍明顯高于Co ntro l組，但卡維地洛（Carv）治療組大鼠體重較 DM組顯著增加（P<0.05），但仍明顯低于NC組。高劑量卡維地洛（CarvH）組較低劑量組

17、（CarvL）相比無顯著差異（P>0.05）；DM組大鼠應用STZ后1周即出現(xiàn)多飲多食、多尿的癥狀，并且逐漸加重，同時出現(xiàn)毛發(fā)變得灰黃、精神萎靡、活動度差的表現(xiàn)。Carv組與DM組相比上述癥狀無明顯改善；DM組大鼠心臟質量/體質量（HW/BW）明顯高于NC組（P<0.05），Carv治療組與 DM組相比（HW/BW）明顯減低（P<0.05），且CarvH組與CarvL組相比差異更明顯（P<0.05）。
　　2.大鼠的心肌組織病理學

18、改變：電鏡觀察：NC組心肌細胞肌節(jié)結構（明帶、暗帶、Z線、M線）清晰可見，細胞連接閏盤結構清楚，肌束間線粒體縱行排列且膜結構完整；DM組部分肌絲、肌節(jié)溶解、斷裂，閏盤間隙消失，線粒體腫脹、部分消失、部分固縮，心肌間質膠原沉積、毛細血管內皮腫脹；Carv組心肌組織改變介于DM組和NC組之間，心肌病變較 DM組明顯減輕，間質膠原沉積較少，毛細血管基底膜增厚減輕。HE染色：切片上可見DM組大鼠心肌細胞肥大且不規(guī)則、細胞排列紊亂、心肌細胞間質及

19、細胞外基質增多、成纖維細胞增多；NC組：大鼠心肌細胞排列整齊、可見少量成纖維細胞、結構清晰；Carv組心肌細胞較 DM組排列更規(guī)則，肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少。通過電鏡及HE染色觀察DM組大鼠糖尿病心肌病模型成功建立。
　　3.大鼠心功能的改變：實驗末，與NC組相比，DM組大鼠左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室收縮末期內徑（LVIDs）均明顯增加（P<0.05）， EF值明顯下降（P<0.05）；而Carv低、高劑量預

20、處理后LVIDd、LVIDs均明顯降低（P<0.05），EF值明顯升高（P<0.05），差異顯著；Carv高劑量組與低劑量組相比LVIDd、LVI Ds數(shù)值均有所減低，EF有所升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與NC組相比，DM組大鼠血漿NT-proBNP水平較顯著升高（P<0.05）；Carv低、高劑量預處理后血漿NT-proBNP水平明顯下降（P<0.05）且 Carv高劑量與低劑量相比血漿NT-proBNP水平下降更明顯

21、，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4.生化指標的改變：與NC組相比，DM組大鼠IL-1β、TNF-ɑ表達水平均增加（P<0.05）而予以Carv低、高劑量預處理后，治療組上述兩種指標表達水平均明顯減低（P<0.05），且高劑量組減低更明顯,差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與NC組相比，DM組大鼠空腹血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）水平均明顯升高（P<0.05）。但Carv低、高劑量組與DM組三組空腹血糖、T

22、G、TC水平無顯著差別，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　5.大鼠心肌細胞凋亡的改變：正常心肌細胞核呈藍色，T UNEL染色凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色，在光鏡下計數(shù)5個高倍視野中凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目及占總細胞核數(shù)目的比例，求其均值得出細胞凋亡陽性指數(shù)AI（Apoptosis Index）。與NC組相比，DM組AI數(shù)值明顯升高，Carv低、高劑量組與DM組相比AI數(shù)值均明顯下降且Carv高劑量組較Carv低劑量組相比下降更明

23、顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western Bolt結果顯示：與NC組相比，DM組大鼠caspase-3蛋白的表達水平明顯升高，Carv低、高劑量藥物干預后caspase-3蛋白表達水平明顯下降，且Carv高劑量組較Carv低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。免疫組化顯示：c asp as e-3以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照除細胞核染成藍色外，胞漿內無棕黃色反應物。與NC組相比，DM組大鼠

24、陽性染色光密度積分明顯增高，Carv低、高劑量藥物干預后caspase-3陽性染色細胞數(shù)明顯下降，且Carv高劑量組較Carv低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6.大鼠心肌組織膠原的變化：Mas son染色結果：NC組大鼠心肌細胞之間、血管周圍有少量膠原纖維；DM組大鼠心肌間質膠原纖維增生明顯、排列紊亂、微血管纖維化明顯，膠原纖維呈紅色分布不均、相互連接成網(wǎng)狀；Carv低、高劑量預處理后大鼠心肌膠原纖

25、維增生均明顯減輕，且Carv高劑量組膠原纖維增生減輕更明顯，更接近于NC組。Mas so n染色心肌膠原分數(shù)（CVF1）:與NC組相比，DM組CVF1數(shù)值明顯升高，Carv低、高劑量預處理后CVF1數(shù)值明顯下降，且Carv高劑量組與低劑量組相比CVF1數(shù)值下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Vimentin染色及Western Blot結果顯示：與NC組相比，DM組大鼠I型膠原蛋白的表達較NC組明顯增加（P<0.05），I

26、型膠原容積分數(shù)（CVF）數(shù)值明顯升高，Carv干預后I型膠原蛋白的表達明顯下降，CVF也明顯減低，且Carv高劑量組較低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　7.Western Bolt結果顯示：與NC組相比p-AKT、p-XIAP蛋白在DM組中表達明顯下降（P<0.05），Carv干預后上述兩者水平明顯升高（P<0.05），且 Carv高劑量組較低劑量組升高更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但

27、是 AKT及 XIAP水平在四組的表達無顯著差異（P>0.05）。
　　8.Western Bolt結果顯示：與 NC組相比, HG組 H9C2心肌細胞caspase-3、TNF-α、I型膠原蛋白及IL-1β的表達水平均明顯升高（P<0.05），Carv藥物干預后上述蛋白的表達水平均明顯下降（P<0.05）；與NC組相比，p-AKT、p-XIAP蛋白在HG組中表達明顯下降，Carv藥物干預后上述兩者的表達水平均明顯升高，差異均具有

28、統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但是AKT及XIAP水平在三組的表達無顯著差異（P>0.05）。其結果與體內模型的結果相似。
　　結論：
　　卡維地洛能夠促進AKT及XIAP的磷酸化，減輕糖尿病心肌病大鼠心肌細胞炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡及心肌纖維化、改善心臟功能。
　　第三部分：PKCβ/P66 shc氧化應激信號轉導通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病變中的表達及卡維地洛的干預研究
　　目的：
　　研究卡維地洛對糖

29、尿病心肌病大鼠PKCβ/p66s hc線粒體氧化應激信號轉導通路的影響。、
　　方法：
　　大鼠血漿丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸反應物顯色分光光度比色法。超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應顯色分光光度比色法測定；應用Western bolt技術檢測大鼠心肌p-PKCβ1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc、caspase-3蛋白的表達。體外高糖環(huán)境培養(yǎng) H9C2心肌細

30、胞，模擬體內模型，同第二部分，應用Western bolt技術檢測p-PKCβ1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc及caspase-3蛋白的表達，應用激光共聚焦技術檢測線粒體活性氧簇（ROS）的表達水平以及p-p66shc在線粒體內的轉位率。
　　結果：
　　1.大鼠癥狀體征、生化指標的改變：HE染色、Mass o n染色、電鏡對超微結構改變的觀察均同第二部分。
　　2.丙二醛（M

31、DA）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測結果：體內實驗結果表明，與NC組相比，DM組大鼠MDA水平明顯升高，SOD水平明顯減低（P<0.05）；與DM組相比卡維地洛治療后MDA水平明顯降低、SOD水平顯著升高（P<0.05），且CarvH與CarvL組相比上述改變更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。體外高糖環(huán)境培養(yǎng)H9C2心肌細胞的結果與體內實驗結果相一致。
　　3.Western bolt顯示：與NC組相比，DM大鼠p-PK

32、Cβ2、p-p66shc及caspase-3蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05）,Carv低、高劑量預處理后上述指標均明顯下降（P<0.05），且Carv高劑量組較低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但是 p-PKCβ1、PKCβ1水平在四組的表達無顯著差異（P>0.05）。體外高糖環(huán)境培養(yǎng)H9C2心肌細胞的結果與體內實驗結果相似。
　　4.體外實驗結果：激光共聚焦結果顯示與NC組相比，HG組線粒體ROS生