基于臨床數(shù)據(jù)的舒筋蠲痹湯處方發(fā)現(xiàn)及其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機制研究.pdf

1、醫(yī)生的診療經(jīng)驗是極其寶貴的財富，是關(guān)系中醫(yī)繼承、創(chuàng)新、發(fā)展的重要問題。隨著科技發(fā)展，越來越多蘊含海量信息的His數(shù)據(jù)醫(yī)院與日俱增，龐大的臨床數(shù)據(jù)如何有效利用，對其蘊含的豐富臨床資料和醫(yī)生寶貴診療經(jīng)驗進行研究和總結(jié)，均是亟需解決的重要問題。
　　全文旨在以楊衛(wèi)彬主任醫(yī)師的臨床His數(shù)據(jù)分析為范例，對中醫(yī)臨床數(shù)據(jù)的應(yīng)用及醫(yī)生診療規(guī)律總結(jié)進行方法學(xué)層面的探討。提出應(yīng)用“跟診學(xué)習(xí)與醫(yī)院數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子機制研究、模型動物機制驗證”四

2、位一體的模式來闡釋中醫(yī)臨床診療規(guī)律，創(chuàng)新了中醫(yī)診療規(guī)律總結(jié)方式和路徑，為指導(dǎo)臨床用藥和新藥研發(fā)提供重要參考。主要通過以下幾個方面的工作進行展開:
　　1.基于數(shù)據(jù)挖掘方法的中藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎核心處方篩選
　　目的:
　　利用數(shù)據(jù)挖掘方法，以導(dǎo)師楊衛(wèi)彬主任醫(yī)師門診His數(shù)據(jù)為例，研究其辨治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)組方用藥規(guī)律，并為研究醫(yī)師治療疾病經(jīng)驗總結(jié)進行方法學(xué)層面的探討。
　　方法:
　　對中國中醫(yī)科學(xué)院西苑

3、醫(yī)院風(fēng)濕科楊衛(wèi)彬主任4年來門診His數(shù)據(jù)，利用中醫(yī)傳承輔助平臺V2.5中集成的熵方法、改進的互信息等方法進行數(shù)據(jù)挖掘，對于其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的用藥特色、配伍規(guī)律進行總結(jié)和挖掘，將其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗?zāi)毘珊诵奶幏健?br>　　結(jié)果:
　　1423個病例中，通過挖掘得到常用藥物50個，主要包括祛風(fēng)濕、溫陽氣、化瘀通絡(luò)、清熱通絡(luò)、強筋骨，如麻黃、桂枝、防風(fēng)、忍冬藤、當歸、附子、懷牛膝等藥物，常用的核心藥物組合56個，如芍藥-甘草，蜈

4、蚣-僵蠶，忍冬藤-玄參-當歸-甘草等。最終得到導(dǎo)師治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心方——舒筋蠲痹湯。該處方核心組成為《金匱要略》治療歷節(jié)病名方，桂枝芍藥知母湯與四妙勇安湯的合方的加減，舒筋蠲痹湯（桂枝、白芍、生甘草，麻黃，生姜，知母，防風(fēng)，附子，金銀花，玄參，當歸，甘草，蜈蚣、僵蠶等）。本方較全面地照顧了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)、寒、濕、瘀、虛各個病理環(huán)節(jié)。
　　對于數(shù)據(jù)挖掘方法獲得的核心處方，需要處方醫(yī)生本人基于專業(yè)判斷進行評價。導(dǎo)師認為該數(shù)據(jù)挖掘

5、結(jié)果與臨床應(yīng)用情況高度一致，此種方法，可以客觀地反應(yīng)其學(xué)術(shù)規(guī)律，并且通過挖掘，使得可使臨床經(jīng)驗、規(guī)律更好地凝練、更直觀地展現(xiàn)。同時，導(dǎo)師臨床驗案，表明挖掘結(jié)果與臨床規(guī)律一致性。
　　2.核心處方優(yōu)化及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機制研究
　　目的:
　　1.在數(shù)據(jù)挖掘所得結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)合專家意見，參合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和藥物臨床應(yīng)用，進一步進行處方優(yōu)化。
　　2.通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對優(yōu)化后的核心方（舒筋蠲

6、痹湯）治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制初步探討。
　　方法:
　　1.分別獲取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎RA相關(guān)靶點和核心方湯藥物潛在靶標。
　　2.分別獲取RA與核心方中單味藥物重合基因，并依據(jù)重合基因的數(shù)量進行處方優(yōu)化，最終確定優(yōu)化的處方——舒筋蠲痹湯。
　　3.對預(yù)測得到RA與舒筋蠲痹湯整體靶標，運用string軟件構(gòu)建Protein-ProteinInteraction(PPI)蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)。并將結(jié)果導(dǎo)入Cytosc

7、ape3.4.0進行拓撲結(jié)構(gòu)值計算，獲得核心的藥物和靶點，并進行網(wǎng)絡(luò)可視化展示。
　　4.篩選得到的藥物-疾病靶標在用DAVID軟件(https://david.ncifcrf.gov/)進行功能注釋生物信息學(xué)分析，富集KEGG通路并進行GO功能富集分析。
　　5.對富集得到的KEGG通路(KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes:http://www.kegg.jp/)。選擇

8、排名前8位的通路，對舒筋蠲痹湯治療RA治療機制做初步探討。
　　結(jié)果:
　　預(yù)測得到與RA相關(guān)的基因共210個，與藥物靶標963個。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)值計算，獲得6個疾病-藥物共同作用的核心蛋白:TNF-α，IFNG(IFN-γ)，IL1B(IL1-β)，TP53，JUN，F(xiàn)OS。通過通路富集分析得到多條KEGG通路，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路，破骨細胞分化通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、MA

9、PK信號通路、細胞因子受體相互作用、及NF-kappaB信號通路。包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路，破骨細胞分化通路、腫瘤壞死因子信號通路等，其與發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)。
　　選取基因富集較多的破骨細胞分化通路進行研究，從抑制破骨細胞分化角度，對中藥舒筋蠲痹湯對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機制進行闡釋。在下文中，我們選取TNF-α，IFNG(IFN-γ)，IL1B(IL1-β)，在模型動物血清中測定含量，對模型動物病變局部蛋白表量進行測定，如核蛋

10、白c-Fos，c-Jun。IL-1和TNF-α，研究早已證明這兩種細胞因子與RA發(fā)病有密切關(guān)系。其與RA在通常在RA患者關(guān)節(jié)滑液中顯著升高，刺激結(jié)締組織細胞和多形核細胞產(chǎn)生前列腺素等小分子炎癥介質(zhì)，通過刺激滑膜細胞和軟骨細胞，使破骨細胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞。而RA患者的滑膜細胞培養(yǎng)和滑膜細胞標本中c-Jun、C-Fos也增高。這些超表達現(xiàn)象集中反映了滑膜間質(zhì)細胞

11、的失調(diào)控和原位活化，導(dǎo)致血管翳象腫瘤樣浸潤使關(guān)節(jié)嚴重損傷。
　　除預(yù)測得到的6個靶標外，為了更清晰說明舒筋蠲痹湯與破骨細胞分化的關(guān)系，進一步選取本通路上的其他關(guān)鍵蛋白，如Rankl、Tranf2、P38及其磷酸化表達的P-p38同時進行研究，以更好地明晰舒筋蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎實現(xiàn)骨保護的作用機制。
　　3.基于模型動物的舒筋蠲痹湯治療機制驗證
　　目的:
　　1.通過模型動物膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎CIA大鼠，進行舒筋

12、蠲痹湯的藥效學(xué)研究。
　　2.在藥效學(xué)研究基礎(chǔ)上，通過檢測Osteoclast differentiation通路上8個蛋白表達量變化，進行舒筋蠲痹湯作用機制探討。
　　方法:
　　根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果，選擇基因富集較多的破骨細胞分化通路進行研究，并在動物模型上進行驗證。選取國際研究RA公認模型，佐劑關(guān)節(jié)炎CIA大鼠模型，以中藥舒筋蠲痹湯高、中、低三種劑量分別給予干預(yù)，以甲氨蝶呤為陽性對照藥，主要藥效學(xué)指標包括:踝關(guān)

13、節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)評分、病理評分、特殊病理染色（針對破骨細胞特異性染色法，酒石酸酸性磷酸酶Trap法）、影像學(xué)(Micro-CT進行影像學(xué)角度進行骨破壞情況評估)等。
　　與此同時對破骨細胞分化通路上通過預(yù)測得到的5個蛋白c-FOS，c-JUN，TNF-α，IFN-γ，IL1-B進行驗證，并在破骨細胞分化通路上另選多個關(guān)鍵蛋白，如Rankl、Traf2，P38等同時研究，運用Western blot，ELISA等方法研究局部組織和血液

14、的蛋白表達水平變化。
　　結(jié)果:
　　通過動物實驗以驗證舒筋蠲痹湯對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療效果，結(jié)果顯示舒筋蠲痹湯低、中劑量能有效減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度及踝關(guān)節(jié)病理損壞程度。初步探討了舒筋蠲痹湯對Osteoclast differentiation通路的調(diào)節(jié)作用，實驗表明該方能夠下調(diào)該通路上游的細胞因子IL1-1，TNF-α和IFN-γ及中游的Traf2、p-p38，及下游核蛋白c-Jun，c-Fos的表達水

15、平，從而控制炎癥的發(fā)展及抑制破骨細胞分壞從而減少骨破壞的形成，為舒筋蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子生物學(xué)作用機制進行了初步驗證，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與模型動物結(jié)合，為中藥復(fù)方處方機理研究提供了新參考。
　　創(chuàng)新點:
　　本研究提出“跟診學(xué)習(xí)與數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子機制研究、模型動物機制驗證”四位一體的模式來闡釋中醫(yī)診療規(guī)律，將跟診高年資醫(yī)生與基于數(shù)據(jù)挖掘的醫(yī)院His數(shù)據(jù)臨床規(guī)律總結(jié)、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方作用機制探討與模型動物的機制

16、驗證等方式有機結(jié)合，創(chuàng)新了中醫(yī)臨床數(shù)據(jù)應(yīng)用模式和診療規(guī)律研究模式。旨在通過傳統(tǒng)中醫(yī)臨床經(jīng)驗總結(jié)方式與現(xiàn)代科研技術(shù)手段相結(jié)合的方式，為中醫(yī)臨床數(shù)據(jù)的利用從方法學(xué)層面進行探討。從臨床到科研，從宏觀到微觀，傳統(tǒng)到新型，為臨床數(shù)據(jù)利用和醫(yī)生診療規(guī)律研究提供新思路、新方法。
　　結(jié)論:
　　“跟診學(xué)習(xí)與His數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子機制研究、模型動物機制驗證”四位一體的模式，利于將宏觀層面大數(shù)據(jù)背景下醫(yī)師診療用藥規(guī)律研究，與微觀層面中