EP3受體激活對(duì)膀胱興奮性影響的作用機(jī)制初探.pdf

1、背景及目的:許多臨床疾病可以導(dǎo)致膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(Overactive Bladder，OAB)，比如泌尿系統(tǒng)的感染、神經(jīng)源性膀胱、間質(zhì)性膀胱炎以及膀胱痛疼綜合征等，除此之外，OAB也可以單獨(dú)發(fā)生。OAB的病人以尿急為主要癥狀，常伴有尿頻和夜尿增多，同時(shí)也會(huì)有尿失禁的發(fā)生，常常給病人帶來(lái)生活上的痛苦和不便，長(zhǎng)期的OAB還可引起輸尿管積水和腎積水，嚴(yán)重?fù)p害腎功能。關(guān)于OAB的發(fā)病機(jī)理一直未能明確闡述，臨床上OAB的治療也一直著重于作用在神經(jīng)

2、受體M受體的藥物，但治療效果有限。所以關(guān)于OAB的研究一直受到眾多的關(guān)注。在OAB的研究過(guò)程中，Joon Chul Kim發(fā)現(xiàn)在OAB的病人膀胱中前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的分泌水平增高，提示PGE2是OAB疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)PGE2可以使膀胱逼尿肌的收縮頻率和幅度增強(qiáng)，但PGE2作用于膀胱引起膀胱過(guò)度活動(dòng)的具體機(jī)制未能明確，推測(cè)PGE2的受體在其中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PGE

3、2的受體EP3可以影響膀胱的排尿間隔和排尿量，同時(shí)，在EP3受體基因敲除的小鼠中，也發(fā)現(xiàn)膀胱排尿量增加;向小鼠的膀胱內(nèi)灌注PGE2可以引起膀胱的過(guò)度活動(dòng)，但在EP3受體敲除小鼠的膀胱中灌注PGE2卻并不能引起膀胱的過(guò)度活動(dòng)。這些研究的發(fā)現(xiàn)提示EP3受體在膀胱過(guò)度活動(dòng)中的重要作用，但EP3受體激活后對(duì)膀胱活動(dòng)的機(jī)制研究同樣也未有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。
　　膀胱的逼尿肌興奮性異常是膀胱逼尿肌過(guò)度活動(dòng)（Detrusor Overactivity

4、，DO）的重要原因，膀胱過(guò)度活動(dòng)癥與逼尿肌過(guò)度活動(dòng)有密切聯(lián)系，所以研究膀胱逼尿肌興奮性的機(jī)制將對(duì)膀胱過(guò)度活動(dòng)癥具有重要意義。許多年來(lái)，一直認(rèn)為膀胱逼尿肌的興奮性受到膀胱神經(jīng)的支配，但隨著研究的深入，尤其是有研究發(fā)現(xiàn)離體膀胱存在節(jié)律性的收縮，人們認(rèn)為膀胱逼尿肌興奮性的神經(jīng)支配學(xué)說(shuō)存在局限性，在膀胱中存在獨(dú)立于神經(jīng)支配的自發(fā)興奮調(diào)控系統(tǒng)，并吸引越來(lái)越多的研究和關(guān)注。隨后，Smet在人體和豚鼠膀胱中發(fā)現(xiàn)c-GMP免疫陽(yáng)性的細(xì)胞在形態(tài)上類似于腸

5、道的卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)，之后通過(guò)ICC細(xì)胞的特異性標(biāo)記c-kit證實(shí)了膀胱ICC細(xì)胞的存在。在腸道中，ICC細(xì)胞具有起搏功能，能夠?qū)⒆陨懋a(chǎn)生的細(xì)胞興奮通過(guò)其與平滑肌細(xì)胞間的緊密連接傳遞到整個(gè)組織，是腸道慢波蠕動(dòng)的發(fā)起者和控制者。ICC細(xì)胞的這些特點(diǎn)，吸引了人們的關(guān)注和研究。人們認(rèn)為在膀胱中，ICC細(xì)胞同樣具有起搏功能，能夠產(chǎn)生細(xì)胞興奮，同時(shí)，這也能很好的解釋膀胱在去除神經(jīng)因素

6、的情況下仍能夠產(chǎn)生自發(fā)收縮的現(xiàn)象。在膀胱活動(dòng)不穩(wěn)定的病人膀胱內(nèi)，有研究發(fā)現(xiàn)ICC細(xì)胞的數(shù)量增多，也提示ICC細(xì)胞在膀胱興奮中占據(jù)重要地位。對(duì)于ICC細(xì)胞的深入研究將對(duì)膀胱興奮調(diào)控機(jī)制以及膀胱的過(guò)度活動(dòng)具有重要意義。
　　在對(duì)膀胱ICC細(xì)胞的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了在膀胱ICC細(xì)胞中存在超極化電壓門(mén)控通道（HCN通道），該通道有4種亞型，能夠在細(xì)胞超極化的情況下被激活，在通道激活后，鈉離子和鉀離子能夠通過(guò)該通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而形成一種內(nèi)向

7、電流，由于該通道的特殊的激活方式，其形成的這種內(nèi)向電流被命名為“funny current”(If)。正是If的存在，使得細(xì)胞能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位，自發(fā)產(chǎn)生興奮。HCN通道首先在心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)其If也被證實(shí)在心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞興奮調(diào)控中的重要作用。目前的研究證實(shí)，HCN通道在膀胱中有且僅在膀胱ICC細(xì)胞上有表達(dá)，通過(guò)蛋白定量等實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，HCN1通道的表達(dá)量最為顯著，而HCN2、HCN3和HCN4通道的表達(dá)量相對(duì)較少。膀胱

8、ICC細(xì)胞上HCN通道表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，為膀胱ICC細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞興奮提供了進(jìn)一步的證據(jù)，同時(shí)也為研究ICC細(xì)胞興奮的產(chǎn)生和調(diào)控提供了新的思路和方向。但關(guān)于膀胱中HCN通道的調(diào)控一直沒(méi)有明確的研究與發(fā)現(xiàn)。
　　綜上所述，我們看到EP3受體的激活對(duì)膀胱功能具有顯著的作用，而基于HCN通道作用的ICC細(xì)胞自發(fā)興奮又在膀胱興奮調(diào)控中起到重要的作用，我們擬研究EP3受體的激活能否通過(guò)作用于ICC細(xì)胞上的HCN通道，影響了ICC細(xì)胞的興奮性調(diào)

9、控，進(jìn)而對(duì)膀胱的功能產(chǎn)生影響與作用。通過(guò)揭示EP3受體激活的作用機(jī)制，既進(jìn)一步地闡明了膀胱興奮調(diào)控機(jī)制，又為臨床膀胱疾病治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　第一部分、EP3受體在膀胱ICC細(xì)胞上的表達(dá)
　　在這一部分中，我們擬采用免疫熒光雙染的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)EP3蛋白和ICC細(xì)胞特異性標(biāo)記c-kit進(jìn)行免疫標(biāo)記，以確定EP3受體在ICC細(xì)胞上的表達(dá)。
　　第二部分、EP3受體對(duì)HCN通道的影響作用
　　(1

10、)我們首先建立EP3受體特異性激動(dòng)劑sulprostone的小鼠膀胱灌注模型，再利用Western blotting的實(shí)驗(yàn)方法比較正常小鼠膀胱中HCN表達(dá)情況和進(jìn)行了sulprostone膀胱灌注的小鼠膀胱中HCN的表達(dá)情況;
　　(2)我們將小鼠膀胱進(jìn)行急性酶分離，將獲得的膀胱ICC細(xì)胞利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)EP3受體的激動(dòng)劑PGE2和sulprostone對(duì)HCN通道電流的影響;
　　(3)我們利用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)我們?cè)谀?/p>

11、片鉗實(shí)驗(yàn)中所用到的細(xì)胞進(jìn)行c-kit的檢測(cè)，以保證我們實(shí)驗(yàn)中記錄的細(xì)胞確實(shí)為ICC細(xì)胞;
　　(4)免疫共沉淀技術(shù)用來(lái)檢測(cè)EP3受體蛋白和HCN通道蛋白是否存在直接的相互作用，以探究EP3受體激活作用于HCN通道的方式方法。
　　第三部分、EP3受體激活對(duì)膀胱ICC細(xì)胞興奮性的影響
　　在此部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先對(duì)小鼠的膀胱ICC細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用鈣負(fù)載技術(shù)，通過(guò)加入EP3受體的激動(dòng)劑PGE2和sulprostone

12、以及HCN通道的阻滯劑ZD7288檢測(cè)EP3受體激活對(duì)膀胱ICC細(xì)胞興奮性的影響，以及這種作用是否通過(guò)HCN通道實(shí)現(xiàn)。
　　第四部分、EP3受體激活對(duì)膀胱肌肉收縮功能的影響
　　在這一部分實(shí)驗(yàn)中，我們加入了HCN1基因敲除小鼠，利用離體膀胱肌條實(shí)驗(yàn)探究EP3受體的激活對(duì)膀胱肌肉收縮功能的作用及影響，并探究這種作用是否通過(guò)ICC細(xì)胞上的HCN通達(dá)完成。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)顯示，EP3受體在膀胱I

13、CC細(xì)胞上有表達(dá);
　　(2)Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，在用EP3受體特異性激動(dòng)劑sulprostone進(jìn)行膀胱灌注的小鼠膀胱中，HCN1和HCN4通道的表達(dá)量比正常小鼠膀胱組織中高，而HCN2和HCN3通道則沒(méi)有差異性;
　　(3)膜片鉗實(shí)驗(yàn)顯示，EP3受體的激動(dòng)劑PGE2和sulprostone均可以使HCN通道的電流增強(qiáng);
　　(4)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，EP3受體蛋白和HCN1及HCN4蛋白存在直

14、接作用;
　　(5)鈣負(fù)載實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EP3受體激活后會(huì)使膀胱ICC細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加，而EP3受體的這種作用可以被HCN通道的阻滯劑ZD7288所阻斷;
　　(6)在離體膀胱肌條實(shí)驗(yàn)中，EP3受體激動(dòng)劑PGE2和sulprostone均能夠使正常小鼠的膀胱肌肉收縮幅度增強(qiáng)，而且這種作用都可以被HCN通道阻滯劑所阻斷;
　　(7)通過(guò)離體膀胱肌條實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先在EP3受體阻滯劑L798106的作用下，PGE2對(duì)大鼠

15、的膀胱肌肉收縮功能沒(méi)有影響;
　　(8)通過(guò)離體膀胱肌條實(shí)驗(yàn)，EP3受體激動(dòng)劑PGE2和sulprostone均可以使HCN1基因敲除小鼠的膀胱肌肉收縮幅度增強(qiáng)，但是PGE2和sulprostone的作用效果均不如在正常小鼠膀胱中的作用效果。
　　結(jié)論:
　　(1)在膀胱ICC細(xì)胞上有EP3受體的表達(dá);
　　(2)EP3受體蛋白能夠直接作用于HCN通道蛋白，從而增強(qiáng)HCN通道的表達(dá)和功能;
　　(3)EP3