胰腺組織工程載體—胰腺體尾部去細(xì)胞化支架的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、本文對(duì)胰腺組織工程載體—胰腺體尾部去細(xì)胞化支架的制備及其應(yīng)用進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：大鼠選擇性胰腺去細(xì)胞化支架的制備和評(píng)價(jià)。
　　目的：通過(guò)去細(xì)胞技術(shù)，經(jīng)全新的動(dòng)脈灌注途徑，創(chuàng)新性選擇胰腺體尾部作為灌注主體，以制備大鼠胰腺體尾部去細(xì)胞化生支架，并全面評(píng)價(jià)所獲得支架的去細(xì)胞化程度、細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成、脈管結(jié)構(gòu)特性、生物活性和組織相容性等。
　　方法：①結(jié)合大鼠胰腺解剖，經(jīng)動(dòng)脈途徑插管，選擇相對(duì)獨(dú)立的大

2、鼠胰腺體尾部作為灌注主體，并優(yōu)化灌注流程，以制作大鼠胰腺體尾部去細(xì)胞化支架。②通過(guò)大體肉眼觀察、HE染色及免疫組化評(píng)價(jià)胰腺支架的去細(xì)胞化效能，通過(guò)膠原蛋白含量分析和氨基聚糖含量檢測(cè)評(píng)價(jià)去細(xì)胞化后支架的基質(zhì)構(gòu)成成分，通過(guò)DNA定量分析檢測(cè)胰腺去細(xì)胞化的支架的有核細(xì)胞殘留情況，通過(guò)美蘭灌注染色及活體動(dòng)脈對(duì)接觀察支架的宏觀脈管結(jié)構(gòu)及循環(huán)密閉性，及通過(guò)透射及掃描電鏡觀察去細(xì)胞化支架的微觀三維脈管結(jié)構(gòu)，并通過(guò)胰腺去細(xì)胞化支架的皮下包埋移植分析以評(píng)

3、價(jià)其免疫原性，并通過(guò)檢測(cè)支架內(nèi)部細(xì)胞因子的含量分析其生物活性以及通過(guò)MTT法對(duì)去細(xì)胞化支架進(jìn)行毒性分析。
　　結(jié)果： ①成功經(jīng)胃左動(dòng)脈插管，順利游離胰腺體尾部分葉，經(jīng)優(yōu)化后的灌注流程，穩(wěn)定且可規(guī)模化獲得大鼠胰腺體尾部去細(xì)胞化生物支架。②大體觀察可見(jiàn)灌注中，胰腺外觀膨隆，內(nèi)部脈管閉合性良好，胰腺組織逐漸由實(shí)體轉(zhuǎn)變?yōu)橥该? HE染色及免疫組化均可觀察到去細(xì)胞化后的支架內(nèi)無(wú)殘留的腺泡或胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu);多種膠原蛋白表達(dá)情況表明了支架保留了完

4、整的基質(zhì)成分，結(jié)合掃描及透射電鏡分析顯示了去細(xì)胞化支架內(nèi)清晰的脈管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DNA定量分析顯示去細(xì)胞化后支架的DNA含量為（42.3±10.6）ng/mg，符合去細(xì)胞化后 DNA殘留量的最低標(biāo)準(zhǔn);而美蘭染色結(jié)果和動(dòng)脈對(duì)接后的血液支架內(nèi)灌注顯示了去細(xì)胞化支架良好的循環(huán)密閉性；結(jié)合免疫原性分析和MTT分析，獲得的胰腺去細(xì)胞化支架無(wú)明顯排斥反應(yīng)及細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性;細(xì)胞因子檢測(cè)也表明支架內(nèi)部仍保留部分生物活性。
　　結(jié)論：經(jīng)

5、胃左動(dòng)脈插管，創(chuàng)新性的選擇胰腺體尾部作為灌注主體，能夠制備良好的大鼠胰腺去細(xì)胞支架，且經(jīng)全面評(píng)價(jià)，保留了完整的基質(zhì)成分和脈管結(jié)構(gòu)，并且具備良好的免疫原性和生物相容性，此外，與所有現(xiàn)有的支架相比，選擇性的胰腺體尾部灌注使得獲得的去細(xì)胞化支架能夠形成具備共同入路和出路的循環(huán)閉合體,使其更有助于回填細(xì)胞的粘附和種植培養(yǎng)以及后續(xù)的體內(nèi)移植應(yīng)用和研究。
　　第二部分：大鼠胰腺去細(xì)胞化支架體外再細(xì)胞化培養(yǎng)和體內(nèi)移植研究。
　　目的：研究

6、前述大鼠胰腺去細(xì)胞化支架的體內(nèi)外應(yīng)用價(jià)值，探討胰島β細(xì)胞（INS-1 E）在去細(xì)胞化三維支架內(nèi)的回填再細(xì)胞化情況，并評(píng)價(jià)去細(xì)胞化支架對(duì)INS-1 E生長(zhǎng)、擴(kuò)增和分泌功能的影響。并進(jìn)一步研究再細(xì)胞化胰腺支架在體內(nèi)以不同方式移植后INS-1 E的功能狀態(tài)和對(duì)糖尿病大鼠的治療作用。
　　方法：⑴大鼠INS-1 E胰島細(xì)胞株擴(kuò)增達(dá)到15*106后通過(guò)動(dòng)脈入路注射回填到去細(xì)胞化支架內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，持續(xù)循環(huán)灌注完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，同時(shí)與支架

7、切片和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行比較研究。我們采用高、低糖刺激實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞定植后的支架內(nèi)胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能，通過(guò)HE染色分析和免疫熒光檢測(cè)評(píng)估回填后的支架內(nèi)細(xì)胞再細(xì)胞化情況。⑵大鼠內(nèi)皮細(xì)胞以相同方法回填種植到去細(xì)胞化支架內(nèi)，行HE及免疫熒光染色分析。⑶通過(guò)腹腔注射鏈脲左菌素（STZ）法制作大鼠Ⅰ型糖尿病模型。⑷成年雄性糖尿病SD大鼠共54只，隨機(jī)分為9組：A組--空白支架整體移植組；B1組--空白支架切片大網(wǎng)膜移植組；B2組--空

8、白支架切片腎周脂肪囊移植組；C組—再細(xì)胞化支架整體移植組；D1組--支架切片后與細(xì)胞共培養(yǎng)大網(wǎng)膜移植組；D2組--支架切片后與細(xì)胞共培養(yǎng)腎周脂肪囊移植組；E組--胰島細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈注射移植組；F組--實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；G組--正常對(duì)照組。⑸所有行移植手術(shù)的大鼠術(shù)前頸內(nèi)靜脈置管經(jīng)皮下包埋固定于背部用于移植前后受體肝素化及術(shù)后補(bǔ)液和靜滴抗生素預(yù)防感染。A組、C組整體移植首先需要切除受體大鼠一側(cè)腎臟，保留該側(cè)腎動(dòng)、靜脈，預(yù)留出該側(cè)腎周脂肪囊空間，將移

9、植物--胰腺體尾部支架的動(dòng)脈入路與腎動(dòng)脈對(duì)接，靜脈出入與腎靜脈對(duì)接，并將移植物置入腎周脂肪囊內(nèi)完成移植。而B(niǎo)組、D組支架切片移植需將支架切成長(zhǎng)約1.5cm，寬約1cm，高約1c m組織塊，與大網(wǎng)膜或者腎周脂肪囊做包埋完成移植。E組經(jīng)門(mén)靜脈注射移植則將相同數(shù)量級(jí)的胰島細(xì)胞一次性注射至門(mén)靜脈完成移植。F組其中3只糖尿病大鼠行左腎切除，3只僅行剖腹探查作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。G組即未經(jīng)任何干預(yù)的糖尿病大鼠作為正常對(duì)照組。⑹通過(guò)檢測(cè)受體小鼠術(shù)后多個(gè)特定時(shí)

10、間點(diǎn)的血糖動(dòng)態(tài)變化，及組織學(xué)HE染色、免疫熒光染色等進(jìn)行移植后移植物的功能狀態(tài)評(píng)價(jià)和降糖效果分析。
　　結(jié)果：①支架切片共培養(yǎng)結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞和胰島細(xì)胞能夠順利貼壁， HE染色見(jiàn)支架內(nèi)散在細(xì)胞定植。而整體支架注射種植后循環(huán)灌注培養(yǎng)可見(jiàn)胰腺支架顏色由透明逐漸變?yōu)辄S白色，培養(yǎng)3天后HE染色見(jiàn)支架脈管結(jié)構(gòu)內(nèi)可見(jiàn)較多種植細(xì)胞粘附排列，并可見(jiàn)部分細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部原實(shí)質(zhì)空間，并定植聚集。高、低濃度糖刺激試驗(yàn)顯示，兩種培養(yǎng)方式下的胰島細(xì)胞均具

11、有較好的胰島素分泌功能。②各組大鼠移植過(guò)程均順利完成，循環(huán)對(duì)接移植手術(shù)時(shí)間最長(zhǎng)，平均90分鐘，而部分支架移植平均手術(shù)時(shí)間50分鐘，門(mén)靜脈注射移植平均手術(shù)時(shí)間30分鐘。整體支架循環(huán)對(duì)接移植組中， A組出現(xiàn)一只大鼠術(shù)后4小時(shí)死亡，考慮并發(fā)嚴(yán)重腦部、肺部栓塞死亡。C組另有一只大鼠術(shù)后并發(fā)嚴(yán)重持續(xù)低血糖（術(shù)后血糖值1.9-2.1mmol/L）于術(shù)后8小時(shí)死亡。各組其余大鼠均存活4周以上，未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的排斥反應(yīng)和明顯的腹腔感染。③再細(xì)胞現(xiàn)化支架整

12、體移植組（C組）大鼠術(shù)后4小時(shí)內(nèi)血糖逐漸開(kāi)始下降（11.5±3.2mmol/L），術(shù)后8小時(shí)血清血糖水平降至6.8±3.6 mmol/L（P＜0.05），術(shù)后1周開(kāi)始血糖出現(xiàn)高低波動(dòng)，并且逐漸上升，至術(shù)后4周血糖達(dá)到13.7±4.2mmol/L。支架切片后與細(xì)胞共培養(yǎng)組（D1、D2組）大鼠術(shù)后8小時(shí)血糖開(kāi)始下降（分別為11.8±1.5 mmol/L，9.5±3.3 mmol/L），24小時(shí)分別降至4.2±1.7 mmol/L、5.3±2

13、.1 mmol/L（P＜0.05），維持1周后血糖開(kāi)始回升。通過(guò)進(jìn)一步移植物的組織病理學(xué)和免疫熒光分析，結(jié)合血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組比較，移植組織能夠在受體內(nèi)存活，并建立胰島素分泌途徑，發(fā)揮控制血糖的治療作用。但支架循環(huán)對(duì)接移植組并未顯示出明顯優(yōu)于門(mén)靜脈注射移植的降糖效果。
　　結(jié)論：結(jié)果證明，我們制備的新型胰腺體尾部去細(xì)胞化支架模型除了具備和其它國(guó)內(nèi)外研究相一致的體外培養(yǎng)的研究應(yīng)用價(jià)值，而且在基于該去細(xì)胞化支架的全新胰島細(xì)胞移