NK細胞在胃癌中的應(yīng)答調(diào)控及作用研究.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率位居世界前列。胃癌的發(fā)生發(fā)展受到胃癌微環(huán)境中各種細胞相互調(diào)控的影響,其中免疫抑制性微環(huán)境的形成與胃癌的進展及病人的臨床預(yù)后不良密切相關(guān)。
　　在胃癌微環(huán)境中,除了腫瘤細胞和固有存在的間質(zhì)細胞,還包括遷移到腫瘤微環(huán)境中來的免疫細胞。研究表明活化的免疫細胞及其效應(yīng)分子在腫瘤組織中的增加通常預(yù)示著患者有較長的生存時間,同時缺乏T、B和NK細胞的重組活化基因2和白介素2受體雙敲除(Rag2-/-

2、PIl2rg-/-)小鼠亦可自發(fā)形成腫瘤并很容易誘導(dǎo)肉瘤。因此,腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),增強機體免疫細胞的效應(yīng)功能很可能成為胃癌免疫治療的新策略。
　　目前認(rèn)為,CD8P+ P細胞毒性T細胞(CD8P+ PCTL)介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中占據(jù)主導(dǎo)地位,CD8+ PCTL在腫瘤微環(huán)境中的增加常提示患者預(yù)后良好。然而,課題組前期的研究顯示CD8+ CTL在胃癌微環(huán)境中受到一群由外周血趨化至腫瘤部位的髓

3、樣來源抑制性細胞的調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致CD8P+ PCTL不能有效清除腫瘤細胞。近年來,NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用越來越受到關(guān)注。NK細胞不僅能夠同CD8P+ PCTL一樣分泌顆粒酶、穿孔素和 IFN-γ作用于腫瘤細胞,而且可以直接靶向識別并以抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性途徑攻擊腫瘤細胞,促使腫瘤細胞裂解死亡。盡管如此,在對已形成腫瘤如肝癌等患者和小鼠誘導(dǎo)腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)NK細胞的功能隨腫瘤的進程明顯受到抑制并與患者的臨床預(yù)后不良相關(guān)。

4、提示NK細胞功能的異常改變可能是導(dǎo)致腫瘤不斷惡化的重要原因。那么,在胃癌微環(huán)境中NK細胞的功能是否受到抑制尚不明確。
　　單核/巨噬細胞是一群浸潤到腫瘤微環(huán)境中影響效應(yīng)性淋巴細胞抗腫瘤應(yīng)答的重要免疫細胞類型。目前認(rèn)為,腫瘤活化的單核細胞是一群具有免疫抑制性的巨噬細胞,其可通過分泌免疫抑制性的因子或上調(diào)表達免疫抑制性的配體作用于淋巴細胞,從而調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖和效應(yīng)功能。目前,在胃癌微環(huán)境中單核/巨噬細胞的免疫學(xué)特性和功能仍存在爭議

5、,并且其在胃癌中是否能夠調(diào)控NK細胞的功能以及具體的調(diào)控機制還不清楚。
　　【研究目的】
　　1.分析NK細胞在胃癌中的分布、受體表達及功能特征;
　　2.探討NK細胞在胃癌中的調(diào)控機制及其臨床意義。
　　【研究方法】
　　1. NK細胞在胃癌中的分布、受體表達和功能特征
　　從重慶西南醫(yī)院普外科收集了65例胃癌病人手術(shù)切除的組織標(biāo)本和外周血,30例健康人外周血作為正常對照。H&E染色確立胃組織標(biāo)本的

6、病理學(xué)特征。利用流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測NK細胞的分布情況。運用流式細胞術(shù)分析NK細胞表面受體和功能相關(guān)分子的表達情況。
　　2. NK細胞在胃癌中的調(diào)控機制
　　流式細胞術(shù)檢測胃癌組織中單核/巨噬細胞的表型,免疫組織化學(xué)雙重染色分析單核/巨噬細胞與NK細胞的共定位情況。
　　購買重慶西南醫(yī)院輸血科的正常人外周血,免疫磁珠分選外周血CD14陽性的單核細胞。條件性外周血單核細胞由25％胃癌細胞系 AGS細胞、

7、胃癌組織和非腫瘤正常組織培養(yǎng)上清與外周血單核細胞共培養(yǎng)12小時所得。
　　在共培養(yǎng)體系中,免疫磁珠分選純化外周血 NK細胞,再按照4:1的比例與同一個體的正?；驐l件性外周血單核細胞進行共培養(yǎng),同時加入 rhIL-2。在上述條件下或?qū)K細胞預(yù)先孵育抗2B4抗體30 min,或直接加入抗TGF-β1抗體進行共培養(yǎng),7天后收集細胞用于NK細胞表面分子染色,或加入PMA和離子霉素刺激以及Golgistop阻斷蛋白轉(zhuǎn)運4-6 h,而后收集

8、細胞流式染色檢測內(nèi)因子的表達,7-AAD/annexinⅤ凋亡檢測試劑盒檢測NK細胞的凋亡情況。此外,體外加入rhTGF-β1直接作用于NK細胞5天,收集細胞進行流式染色檢測。
　　3. NK細胞對胃癌病人預(yù)后的影響
　　統(tǒng)計65例胃癌病人的臨床信息,根據(jù)國際腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床TNM分期,胃癌病人的總生存率從手術(shù)當(dāng)天算起,直到死亡或者最后一次隨訪。利用Mann Whitney非參檢驗比較兩組間的差異,單因素方差分析比較多組

9、間的差異。Kaplan-Meier方法計算病人的累計生存時間, log-rank檢驗比較兩組生存率的差異。采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和圖形繪制,P<0.05可認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　【研究結(jié)果】
　　1. NK細胞在胃癌中的分布、受體表達及功能特征
　　1.1流式染色結(jié)果統(tǒng)計分析顯示:NK細胞、NKT細胞和T細胞在正常人外周血中的百分率分別為18.03%±1.82%、3.25%±0.38%和

10、52.47%±2.56%,在胃癌病人外周血中的百分率分別為18.00%±1.67%、2.92%±0.40%和53.00%±2.08%;在胃癌病人非腫瘤正常組織中的百分率分別為4.41%±0.38%、0.93%±0.14%和16.24%±2.03%,在癌旁組織中的百分率分別為3.55%±0.25%、1.06%±0.15%和22.27%±2.09%,在癌組織中的百分率分別為2.38%±0.17%、1.29%±0.19%和29.82%±2.0

11、2%。獨立T檢驗比較顯示這三群細胞在正常人和胃癌病人外周血中的百分率無統(tǒng)計學(xué)差異,但在外周血中的百分率均顯著高于組織標(biāo)本中的百分率。在組織標(biāo)本中,NK細胞在癌組織中的百分率顯著低于癌旁組織和非腫瘤正常組織;反之,T細胞在胃癌組織中的百分率則顯著高于癌旁組織和非腫瘤正常組織。進一步通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),NK細胞在胃癌組織中的浸潤較癌旁組織和正常組織少。
　　1.2與正常外周血NK細胞相比,胃癌病人外周血NK細胞低表達活化型受體N

12、KG2D、NKp30和DNAM-1。而在胃癌病人組織中,與癌旁組織和正常組織中的NK細胞相比,胃癌組織浸潤的NK細胞低表達CD16,而NKp44和2B4的表達則有所增加。但另外兩個自然殺傷受體NKp30、NKp46以及其他的活化型受體NKG2D、DNAM-1和CD94則無明顯改變。此外,抑制型受體NKG2A、CD158a/h、CD158b和CD158e1在各組織NK細胞中所占的百分率也無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　1.3與癌旁組織和正常組織

13、相比,胃癌組織浸潤的NK細胞高表達細胞活化分子CD69,但與細胞增殖相關(guān)的分子Ki-67的百分率則明顯較低,同時誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡相關(guān)配體TRAIL和細胞內(nèi)因子IFN-γ的表達也顯著下降。盡管穿孔素在腫瘤組織中并無顯著變化,但是介導(dǎo)NK細胞脫顆粒的毒性功能分子CD107a在胃癌浸潤的NK細胞中的表達卻顯著下降。
　　2. NK細胞在胃癌中的調(diào)控機制
　　2.1流式檢測發(fā)現(xiàn)胃癌浸潤的CD14陽性單核細胞共表達CD68,且高表達共

14、刺激分子CD80,CD86和HLA-DR,同時上調(diào)表達CD16,Tie-2和CD163,提示其是一群被激活的具有免疫抑制性的巨噬細胞。相關(guān)性分析結(jié)果顯示胃癌浸潤的單核細胞與NK細胞成負(fù)相關(guān)。在胃癌組織中,免疫組織化學(xué)雙重染色發(fā)現(xiàn) CD68陽性巨噬細胞與NK細胞存在相互接觸的現(xiàn)象。
　　2.2相比未經(jīng)處理的單核細胞,胃癌細胞系培養(yǎng)上清作用后的條件性外周單核細胞能夠促進NK細胞上調(diào)CD69分子的表達,但同時也能下調(diào)增殖和效應(yīng)功能相關(guān)分

15、子Ki-67、Perforin、TRAIL以及抑制IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。NK細胞活性分析顯示兩組單核細胞誘導(dǎo)NK細胞凋亡的能力無差異。上述結(jié)果提示條件性單核細胞可促進NK細胞的活化,但是顯著抑制了NK細胞的增殖和效應(yīng)功能。
　　2.3相比未經(jīng)處理的單核細胞,胃癌細胞系作用的條件性外周單核細胞并不上調(diào)CD48、PD-L1和PD-L2以及CD155和CD112分子的表達,流式細胞術(shù)檢測胃癌組織和正常組織中CD48、PD-L1和

16、PD-L2以及CD155和CD112在單核細胞的表達也無統(tǒng)計學(xué)差異。在外周NK細胞與胃癌細胞系作用的單核細胞共培養(yǎng)體系中,預(yù)先孵育抗2B4抗體阻斷CD48/2B4信號不能有效逆轉(zhuǎn)單核細胞對NK細胞的抑制。但加入抗TGF-β1抗體后則發(fā)現(xiàn)NK細胞的功能得以恢復(fù)。此外,利用胃癌組織培養(yǎng)上清作用的單核細胞也能夠顯著抑制NK細胞表達IFN-γ和TNF-α,加入抗TGF-β1抗體后則能夠恢復(fù)NK細胞的功能。進一步體外直接加入rhTGF-β1可導(dǎo)致

17、NK細胞下調(diào)Ki-67和IFN-γ的表達。上述結(jié)果表明TGF-β1信號在腫瘤活化的單核細胞抑制NK細胞的功能中發(fā)揮了重要作用。
　　3. NK細胞對胃癌病人預(yù)后的影響
　　胃癌組織大于5cm或腫瘤侵襲晚期的病人腫瘤中NK細胞的百分率顯著低于胃癌組織小于5cm或腫瘤侵襲早期的病人,有神經(jīng)侵襲、淋巴結(jié)和遠端轉(zhuǎn)移的病人腫瘤中NK細胞的百分率顯著低于沒有神經(jīng)侵襲和淋巴結(jié)及遠端轉(zhuǎn)移的病人。進一步TNM分期顯示胃癌病人癌組織、癌旁組織和

18、非腫瘤正常組織中NK細胞的百分率隨胃癌的進展均逐漸下降,但癌組織中的NK細胞百分率與胃癌的進展成顯著負(fù)相關(guān)。根據(jù)胃癌組織中NK細胞百分率的中位數(shù)(2.36%)將病人分為高、低兩組,隨訪時間為20個月。通過對病人的生存率進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)高NK細胞百分率的病人組生存率顯著高于低NK細胞百分率的病人組。
　　【結(jié)論】
　　1.與T細胞在胃癌中浸潤增加相反,腫瘤內(nèi)NK細胞的百分率顯著低于癌旁組織和正常組織。盡管NK細胞表面的活化型受