一氧化碳在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著肝移植技術(shù)的日益成熟，供肝短缺已成為比移植后排斥反應(yīng)、外科并發(fā)癥以及感染更為嚴(yán)峻的全球性問題，由此導(dǎo)致邊緣性供肝的使用逐漸增加[1]。但是，邊緣性供肝對缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）極其敏感，導(dǎo)致此類肝移植受者的預(yù)后很差[2]，嚴(yán)重時可危及患者生命。目前許多針對IRI的防治方法效果均有限，難以滿足臨床需求，因此需要尋找針對肝臟IRI新型的更為有效的治療方案。一氧

2、化碳（Carbon monoxide，CO）是一種十分重要的細(xì)胞信使分子，具有抗炎、抗凋亡等作用，最近的研究發(fā)現(xiàn) CO可能還參與影響細(xì)胞的自噬過程。目前關(guān)于自噬在肝臟IRI中的作用方式尚不明確，其具體機(jī)制研究較少。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)利用體外肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞低濃度血清培養(yǎng)和缺氧復(fù)氧模型，以及體內(nèi)肝臟缺血再灌注損傷模型，深入探討可溶性一氧化碳釋放分子CORM-2在肝臟IRI中的作用及可能的新機(jī)制。
　　方法：
　　1

3、.模擬嚴(yán)重肝損傷時的缺血微環(huán)境，在體外建立肝前體細(xì)胞WB-F344低濃度（4％）血清培養(yǎng)模型，探討CORM-2治療對WB-F344細(xì)胞活性和增殖的影響，初步研究在應(yīng)激環(huán)境中自噬對肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)分為五組：10%FBS組；4%FBS組；4%FBS+iCORM-2組;4%FBS+CORM-2組以及4%FBS+CORM-2+3-MA組。CCK-8檢測細(xì)胞活力和增殖情況；吖啶橙染色檢測自噬小體的形成情況；Western-Blot檢測AKT

4、、p-AKT、p-mTOR、HO-1、自噬相關(guān)蛋白LC3-I、LC3-II的表達(dá)情況；
　　2.分離原代大鼠肝細(xì)胞，在體外檢測CORM-2治療對肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的影響，并探討自噬在肝細(xì)胞H/R中的作用。實(shí)驗(yàn)分為四組：DMSO空白對照組；無活性iCORM-2陰性對照組；CORM-2實(shí)驗(yàn)組以及CORM-2+3-MA自噬抑制組。采用兩步膠原酶灌注法分離細(xì)胞，觀察原代大鼠肝細(xì)胞貼壁情況，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性狀態(tài)，取生長狀態(tài)

5、良好的原代肝細(xì)胞，在體外缺氧條件下培養(yǎng)4小時，并經(jīng)歷復(fù)氧過程。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用全自動生化儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)變化評價細(xì)胞損傷程度；Western-Blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-I和LC3-II的表達(dá)，判斷細(xì)胞自噬水平改變；
　　3.建立大鼠70%肝臟缺血再灌注損傷模型，在體內(nèi)檢測CORM-2治療對肝臟IRI的影響。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為Sham組和IRI組，每組分別給予Vehicle和CORM-2治療。大鼠

6、術(shù)前禁食，在環(huán)境溫度26℃下，Sham組僅做腹部切開，立即取血樣和肝臟標(biāo)本；IR I組應(yīng)用顯微血管夾阻斷肝左、肝中葉脈管的血供，造成肝左葉與肝中葉缺血，即70%肝組織缺血。IRI組血流阻斷1h后開放，分別于恢復(fù)血流后1h和6h處死大鼠，并留取血樣和肝臟標(biāo)本。全自動生化儀檢測谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶變化評價肝功能變化。肝組織行HE和TUNEL染色評價肝損傷程度；實(shí)時定量PCR檢測組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)變化評

7、價組織炎性反應(yīng)；Western-Blot測定LC3-I和LC3-II蛋白的表達(dá)情況，評價組織自噬活性；
　　4.利用自噬抑制劑3-MA聯(lián)合CORM-2治療，反向驗(yàn)證自噬在肝臟IRI中的作用。重建大鼠70%肝臟IRI模型，于術(shù)前1h靜脈給予3-MA聯(lián)合CORM-2治療，對照組僅給予CORM-2。于恢復(fù)血流后6h處死大鼠，留取血樣和肝臟標(biāo)本，檢測谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶變化評價肝功能；肝組織行 HE染色檢查評價組織損傷程度；Western-B

8、lot測定LC3-I和LC3-II蛋白的表達(dá)變化，檢測組織自噬發(fā)生情況。
　　結(jié)果：
　　1.4%FBS培養(yǎng)條件下，WB-F344細(xì)胞生長相對緩慢，細(xì)胞活性和增殖能力下降；CCK-8結(jié)果提示CORM-2治療能提高WB-F344細(xì)胞活性，促進(jìn)其增殖；吖啶橙染色顯示，CORM-2治療使胞質(zhì)內(nèi)橘紅色熒光增強(qiáng)，提示細(xì)胞自噬小體形成活躍；同時 Western-Blot結(jié)果顯示 p-AKT、p-mTOR表達(dá)下調(diào)， HO-1蛋白表達(dá)增加，

9、 LC3-II/LC3-I的比值顯著增大；3-MA干預(yù)后，CORM-2治療效果被逆轉(zhuǎn)。
　　2.原代分離的大鼠肝細(xì)胞狀態(tài)良好，24小時后細(xì)胞均實(shí)現(xiàn)貼壁，臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率達(dá)90%以上。在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測到谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放，提示細(xì)胞出現(xiàn)明顯應(yīng)激損傷；在給予CORM-2治療后，生化檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放減少，同時Western-Blot結(jié)果顯示LC3-II的表達(dá)增加，而LC3-I的表

10、達(dá)下調(diào)；3-MA干預(yù)后，CORM-2治療效果被逆轉(zhuǎn)。
　　3.大鼠肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能損害，血清谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；CORM-2預(yù)處理使再灌注后1h和6h兩個時間點(diǎn)的谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低，提示肝功能損傷程度減輕；組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)IRI可使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死，而CORM-2治療可顯著減輕肝組織中的細(xì)胞凋亡；實(shí)時定量PCR發(fā)現(xiàn)， IRI肝組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)上

11、調(diào)，而給予CORM-2治療后其表達(dá)水平降低；Western-Blot結(jié)果提示CORM-2治療可使LC3-II的表達(dá)增高， LC3-II/LC3-I的比值顯著增大。
　　4.同CORM-2組比較，給予自噬抑制劑3-MA聯(lián)合CORM-2治療后，血清中谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶出現(xiàn)反跳升高，提示CORM-2的肝臟保護(hù)作用被解除；組織學(xué)檢查亦證實(shí)，3-MA可導(dǎo)致肝組織炎性反應(yīng)加重，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死增多；Western-Blot結(jié)果顯示3-MA處理后自

12、噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)降低，而LC3-I分子表達(dá)增高，自噬被抑制。
　　結(jié)論：
　　一氧化碳釋放分子CORM-2通過釋放CO有利于維持應(yīng)激環(huán)境下WB-F344細(xì)胞的活性和增殖能力；同時，CORM-2治療可減輕體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷；此外，CORM-2可在體內(nèi)環(huán)境中減輕肝組織缺血再灌注損傷，發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過抑制AKT/mTOR信號軸，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，抑制細(xì)胞凋亡，而HO-1可能也參與了此過程