MiR-186靶向抑制胱硫醚-γ-裂解酶對THP-1巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響.pdf

1、目的：富含脂質(zhì)的巨噬細胞蓄積是動脈粥樣硬化損傷的主要特征之一，主要發(fā)生在主動脈分支處。有研究表明miR-186在心肌損傷和心肌梗死中高表達，同時在動脈粥樣硬化性疾病中起重要作用，但其背后作用機制尚不明確。值得注意的是，在本課題組之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)H2S可以通過降低巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積及促炎因子的分泌改善動脈粥樣硬化。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是心血管系統(tǒng)中H2S生成的關鍵限速酶。在本研究前期預實驗中發(fā)現(xiàn)miR-186能與CSE mR

2、NA3’UTR端結合。本課題的研究旨在探討miR-186是否通過靶向作用于CSE繼而促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌，并對其相關作用機制進行了初步探討。
　　方法：首先用生物信息學軟件分析miR-186與人源CSE mRNA3’UTR序列基本情況；接著利用雙熒光素酶報告基因分析檢測了miR-186與人源CSE mRNA3’UTR的結合情況，同時證實了miR-186確實能與人源CSE mRNA3’UTR結合；此外，我

3、們利用脂質(zhì)體2000分別將scrambledmiR-186、miR-186 mimic和miR-186 inhibitor轉染到THP-1泡沫源性巨噬細胞，用高效液相色譜法（HPLC）分別檢測了細胞內(nèi)膽固醇酯（CE）、游離膽固醇（FC）及總膽固醇（TC）水平；Elisa檢測細胞上清液中炎癥因子的含量變化；用Western blot和RT-PCR分別檢測細胞內(nèi)CSE和LPL蛋白及mRNA的表達；采用亞甲基藍法結合分光光度儀檢測內(nèi)源性H2S

4、的含量。利用CSEsiRNA干擾CSE的表達，使其表達降低。
　　結果：通過生物信息學相關分析和雙熒光素報告酶基因檢測，發(fā)現(xiàn)miR-186恰好具有靶向調(diào)控CSE的生物信息學基礎，能直接抑制CSE蛋白和mRNA的表達。同時，我們分別利用高效液相色譜（HPLC）法和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)miR-186能促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。有研究表明，上調(diào)CSE/H2S信號通路有顯著的抗動脈粥樣硬化作用，基于此，推測miR-1

5、86可能是通過抑制CSE促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。由于CSE是心血管系統(tǒng)中內(nèi)源性H2S生成的關鍵限速酶，CSE mRNA和蛋白的表達水平的降低直接導致巨噬細胞內(nèi)H2S的生成量減少。而在本研究中內(nèi)源性H2S含量的變化，影響了THP-1巨噬細胞內(nèi)LPL mRNA和蛋白的表達，二者的變化呈負相關。而且巨噬細胞源性LPL是巨噬細胞泡沫化的一個重要因素，LPL活性及表達的增強促進了巨噬細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌。