軟骨再生支架的構(gòu)建及其對骨軟骨缺損的原位誘導(dǎo)再生研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)部缺少淋巴管及血管。組織內(nèi)的軟骨細(xì)胞具有較低的遷移及增殖能力。因此軟骨缺損難以實現(xiàn)自我修復(fù)?，F(xiàn)有的臨床治療手段難以實現(xiàn)軟骨缺損結(jié)構(gòu)和功能的再生。基于細(xì)胞治療的軟骨組織工程拓展了軟骨缺損的治療方法。體外構(gòu)建的工程化軟骨與天然軟骨相比具有較大的結(jié)構(gòu)差異。體內(nèi)植入后難以實現(xiàn)其與天然軟骨的良好結(jié)合。采用含細(xì)胞的軟骨組織工程支架可實現(xiàn)軟骨缺損的原位修復(fù)，但該方法仍面臨細(xì)胞數(shù)量及其分化行為的調(diào)控問題。同時，軟骨組織工程往往涉及復(fù)雜、耗

2、時的體外構(gòu)建過程，因此難以在臨床上實現(xiàn)推廣應(yīng)用。通過原位募集細(xì)胞可以實現(xiàn)軟骨組織的原位誘導(dǎo)再生。該方法可以避免軟骨組織工程中使用細(xì)胞時面臨的諸多問題。迄今為止，能夠?qū)崿F(xiàn)軟骨缺損原位誘導(dǎo)再生的生物支架鮮有報導(dǎo)。構(gòu)建適宜的支架以促進(jìn)軟骨組織的原位誘導(dǎo)再生是亟待解決的問題。
　　纖維蛋白原具有促進(jìn)干細(xì)胞募集及軟骨形成的作用。本課題通過致孔劑脫除法制備了纖維蛋白大孔支架。采用不同的致孔劑用量可以調(diào)控支架內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)、孔隙率及機械性能。該支

3、架具有良好的細(xì)胞相容性，能夠有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在支架內(nèi)部的增殖。將該支架移植到兔子股骨滑槽骨軟骨缺損(直徑4mm，深度4mm)12w后，缺損處的新生組織與周圍組織結(jié)合性良好，并實現(xiàn)軟骨層及軟骨下骨的再生。軟骨層中具有明顯的粘多糖(GAGs)及Ⅱ型膠原的沉積。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)及Western blotting(WB)表征證明，新生組織中骨軟骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)量較天然軟骨顯著增加。纖維蛋白大孔

4、支架在無細(xì)胞負(fù)載時能夠?qū)崿F(xiàn)骨軟骨缺損的原位誘導(dǎo)再生。這種特質(zhì)為纖維蛋白大孔支架在臨床上的便捷應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　聚（乳酸-co-羥基乙酸）(PLGA)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的有機合成高分子。本課題采用定向冷凍結(jié)晶的方法制備了具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架。該支架具有與天然軟骨類似的壓縮模量，因此可將其應(yīng)用在關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重及非負(fù)重部位的缺損修復(fù)。體外實驗證明，BMSCs能夠沿著取向孔快速地向支架深處遷移、滲透，并取向排列。細(xì)胞的

5、有序排列可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的規(guī)則分布，從而促進(jìn)軟骨組織的結(jié)構(gòu)重塑。體內(nèi)植入12w后，徑向取向孔PLGA支架能夠有效促進(jìn)骨軟骨缺損部位軟骨層及軟骨下骨的再生。新生組織與周圍組織緊密結(jié)合，并具有光滑、平整的表觀形貌。同時，新生軟骨層中細(xì)胞具有與天然軟骨的一致的空間排列。但是，新生軟骨層中GAGs及Ⅱ型膠原的沉積量明顯低于天然軟骨。由于取向孔結(jié)構(gòu)對細(xì)胞遷移、組織結(jié)構(gòu)重塑及組織結(jié)合性的促進(jìn)作用，可對徑向取向孔PLGA支架進(jìn)行進(jìn)一步的生物活性

6、改性，從而促進(jìn)該支架在骨軟骨缺損原位誘導(dǎo)再生領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。
　　透明質(zhì)酸(HA)具有與GAGs相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。同時，HA能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖及BMSCs向軟骨細(xì)胞的分化。HA被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎引起的軟骨疾病治療中。通過酯交換反應(yīng)合成了帶有甲基丙烯酸酯基團(tuán)的HA(HA-MA)，然后采用定向冷凍結(jié)晶的方法制備了具有徑向取向孔結(jié)構(gòu)的HA-MA支架。紫外光交聯(lián)后，支架中的孔結(jié)構(gòu)具有良好的穩(wěn)定性。將PLGA復(fù)合到HA-MA支架中可顯著提

7、高支架的機械性能，從而進(jìn)一步穩(wěn)定支架內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)，并提高體內(nèi)植入時的可操作性。將該支架在無細(xì)胞負(fù)載情況下移植到兔子股骨滑槽骨軟骨缺損部位。術(shù)后12 w，缺損部位的新生組織具有明顯的潮線結(jié)構(gòu)。新生軟骨層含有均一分布的GAGs及Ⅱ型膠原。同時，新生軟骨層中的細(xì)胞表現(xiàn)出分層排布的特點。與天然軟骨一致，新生軟骨中的細(xì)胞在軟骨深層表現(xiàn)出肥大形態(tài)，并特異性分泌Ⅹ型膠原。基于以上結(jié)果，無細(xì)胞徑向取向孔HA-MA/PLGA支架有望在臨床上實現(xiàn)骨軟骨缺損