胃癌相關環(huán)狀RNA的鑒定及其生物學功能的研究.pdf

1、研究目的：
　　胃癌(gastric cancer，GC)是人類最為常見的惡性腫瘤之一，目前我國的胃癌死亡率仍呈上升趨勢，其主要原因還是在于早期胃癌發(fā)現(xiàn)率較低，而胃癌治療的早與晚，效果卻是非常不一樣的。早期胃癌術后5年生存率可高達90％～95％，但是如果一旦發(fā)展到了晚期，那么其死亡率就會很高了。因此，我們若在胃癌早期能找到穩(wěn)定的、有效的、理想的胃癌分子診斷標志物，那對早期胃癌的診斷是至關重要的，也許可能效降低胃癌的死亡率。

2、　　環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一類新穎的非編碼RNA。與之前我們研究較多的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)相比，它具有在血漿和胃液中更加穩(wěn)定存在這一顯著特點，從而使其成為早期胃癌分子診斷標志物的理想選擇更加具有優(yōu)勢。但是由于對 circRNA的研究才剛剛起步，目前，針對circRNA在人類疾病尤其是在腫瘤中生物學功能的研究

3、更是少之又少。因此，本研究擬對胃癌相關 circRNA進行篩選鑒定后，研究其在臨床診斷中的價值，尋找最佳早期胃癌分子診斷標志物，及其對細胞周期、凋亡、增殖、遷移等生物學功能的體外研究以及通過建立裸鼠胃癌移植瘤實驗對它們的體內研究。
　　研究方法：
　　1.結合circRNA數(shù)據(jù)庫，篩選胃癌相關circRNA。
　　2.應用定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-p

4、olymerase chain reaction，qRT-PCR)技術對101對癌旁組織和配對的胃癌組織中 circRNA002059和circRNA001013的表達水平進行檢測，同時結合患者的臨床病理資料，分析它們在臨床診斷中的價值，篩選有效的分子診斷標志物。
　　3.從細胞水平重點鑒定胃癌相關 circRNA001013的表達水平，同時應用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)技術對circ

5、RNA001013在體外細胞水平進行干擾后，研究其生物學功能。
　　4.運用實時細胞分析儀(real-time cellular analysis，RTCA)和流式細胞術分別檢測下調circRNA001013后對細胞增殖能力、細胞周期和凋亡的影響；運用劃痕實驗檢測下調circRNA001013后對細胞遷移能力的影響；運用Western blot實驗檢測下調circRNA001013后相關蛋白質表達水平的變化。
　　5.建立裸

6、鼠胃癌移植瘤模型，從體內水平觀察下調 circRNA001013后腫瘤大小的變化，HE染色研究腫瘤形態(tài)學的改變，運用Western blot實驗和免疫組化檢測分析蛋白質表達水平的變化。
　　研究結果：
　　1. qRT-PCR實驗結果顯示，胃癌相關circRNA002059和circRNA001013在胃癌組織中均為低表達，在臨床診斷中也具有一定的診斷價值，circRNA002059與性別（P=0.002）、年齡（P=0.0

7、22）、遠處轉移（P=0.03）和TNM分期（P=0.042）存在著一定的關系，而 circRNA0010103則與性別（P=0.001）、轉移（0.046）和 TNM分期（0.024）存在著一定的關系，且兩者均能作為胃癌分子診斷標志物。circRNA001013在胃癌細胞株（MGC-803、SGC-7901、HGC-27、BGC-823和 AGS）的表達相比于正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)均為低表達，其結果與組織結果相一致。

8、　　2. RTCA細胞增殖實驗結果顯示，細胞增殖能力經下調 circRNA001013后有所降低(P<0.01)；細胞凋亡和周期實驗結果經流式細胞術檢測后發(fā)現(xiàn)，下調 circRNA001013后沒有發(fā)現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，而細胞周期卻被阻滯在G0/ G1期，；細胞劃痕實驗結果顯示，下調circRNA001013后細胞遷移能力降低(P<0.05)；Western Blot細胞實驗結果顯示，下調circRNA001013后細胞內基質金屬蛋白酶-2

9、(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9、細胞周期素依賴的蛋白激酶-6(cyclin-dependent kinase-6，CDK6)、細胞周期素 D1(cyclin D1)蛋白質表達水平明顯降低(P<0.01)。
　　3.裸鼠胃癌移植瘤實驗結果顯示，下調circRNA001013后腫瘤生長速度減慢，腫瘤體積變??；HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤形態(tài)發(fā)生改變；Western Blot和免疫組化結果均顯示，下

10、調circRNA001013后細胞周期蛋白 CDK6和 cyclinD1，轉移相關蛋白 MMP-2、MMP-9、血管內質生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和增殖相關蛋白核相關抗原(nucleus related antigen，Ki67)表達水平降低，而上皮-鈣黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平增加，且呈一定的劑量效應。
　　研究結論：
　　1.胃癌相關circRN

11、A002059和circRNA001013在胃癌組織中均為低表達。在臨床診斷中具有一定的診斷價值，能作為臨床分子診斷標志物。
　　2.體外細胞水平實驗顯示，下調circRNA001013后可有效降低細胞的增殖能力；阻止細胞從 G0/ G1過渡到 S期；能有效抑制癌細胞的遷移能力；降低細胞內 cyclin D1、CDK6、MMP-2和MMP-9等細胞周期和轉移蛋白的表達。
　　3.體內裸鼠胃癌移植瘤實驗說明，下調circRNA