StarD7及Wnt-β-Catenin信號(hào)通路在annexin5刺激Leydig Cell睪酮合成過(guò)程中的機(jī)制研究.pdf

1、膜聯(lián)蛋白5（annexin 5）是一種鈣離子依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，其分子量約為36kD，annexin 5因?yàn)槠浠?'區(qū)域不含有TATA閱讀框，而被認(rèn)為是一管家基因。其具有多種生物學(xué)功能，如抗凝血、抑制蛋白酶C的活性等。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，annexin 5對(duì)睪酮合成的調(diào)控作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　StarD7是類(lèi)固醇敏感性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關(guān)脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員之一，該蛋白在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞代謝、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。其全長(zhǎng)序列中含有一個(gè)類(lèi)固醇敏感性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關(guān)脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)域（START），該結(jié)構(gòu)域由210個(gè)氨基酸殘基組成，可特異性的結(jié)合脂類(lèi)，如磷脂類(lèi)、甾醇類(lèi)、鞘脂類(lèi)等。其主要參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，它能與膜上的靶蛋白結(jié)合，并發(fā)揮著催化劑的作用。
　　本課題組先前的研究利用二維凝膠電泳技術(shù)建立了annexin 5刺激大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮分泌的差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)在annexin 5刺激的Leydig

3、細(xì)胞中上調(diào)蛋白有23個(gè)，下調(diào)蛋白有13個(gè)，其中StarD7是典型的上調(diào)蛋白。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與StarD7蛋白的起始調(diào)控。
　　StarD7和Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)annexin 5刺激大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成，為回答這個(gè)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)從以下三部分展開(kāi):
　　第一部分，觀察StarD7、β-catenin參與調(diào)控annexin 5刺激大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的過(guò)程，結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)，在annexin5刺激作用下，伴隨著睪酮合成的增加，StarD7、β-catenin在蛋白表達(dá)水平均有所增加，并且免疫熒光的結(jié)果顯示，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)有聚集并進(jìn)入核內(nèi)的趨勢(shì)。
　　第二部分，利用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑Dkk1與A5共同作用于原代睪丸Leydig細(xì)胞，觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制后，大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮合成是否有變化。初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Dkk1的單獨(dú)作用下，睪酮、

5、StarD7、β-catenin、3β-HSD、17β-HSD的表達(dá)均有所下降，且在Dkk1和A5共同作用下，與單獨(dú)A5作用相比，睪酮、StarD7、β-catenin、3β-HSD的表達(dá)均有不同程度的下降。由此提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路參與Leydig細(xì)胞睪酮合成，并可能是通過(guò)StarD7、3β-HSD來(lái)具體調(diào)控睪酮合成的過(guò)程。
　　第三部分，利用siRNA干擾技術(shù)干擾StarD7蛋白的表達(dá)，觀察StarD7被干擾后

6、大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮合成是否有影響。為提高siRNA干擾效率，我們進(jìn)行了一系列的條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞密度為80％、siRNA-StarD7干擾濃度為100 nmol/L、siRNA-StarD7與GenEscortTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑的比例為1∶2的條件下，干擾效果較好。在此基礎(chǔ)上，在StarD7的表達(dá)被干擾后，睪酮合成明顯下降，其關(guān)鍵合成調(diào)節(jié)酶3β-HSD、17β-HSD在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性下降。由此說(shuō)明，睪酮的合成可