αA晶體蛋白對視神經損傷后星形膠質細胞和RGCs軸突的作用及機制研究.pdf

1、由外傷、缺血、青光眼等導致的急性視神經損傷(optic nerve injury)是眼科常見的損傷類型，約占顱腦外傷的2％～5％，也是神經性致盲重要原因之一，迄今仍缺乏有效的治療手段。視神經損傷修復與再生途徑及其機制研究已成為當前神經科學的熱點，也是眼科臨床迫切需要解決的問題。視神經損傷后難以再生，其原因有神經損傷后Caspase-3、RhoA/Rock、Nogo-A等凋亡信號的激活以及去靶細胞提供的營養(yǎng)物質丟失導致視網膜神經節(jié)細胞(r

2、etinal ganglion cells，RGCs)繼發(fā)性凋亡，視網膜和視神經膠質細胞的反應性增生形成膠質瘢痕使RGCs軸突難以穿透。另外，反應性增生的膠質細胞還會釋放一些細胞外基質成分如硫酸軟骨素酸性糖蛋白(CSPGs)形成抑制微環(huán)境，進一步抑制軸突再生和延長。
　　促進RGCs軸突再生的主要辦法有補充外源性神經營養(yǎng)因子如腦源性神經生長因子(BDNF)、睫狀神經生長因子(CNTF)、神經生長因子(NGF)等，但這些外源性因子的

3、補充只能維持RGCs的短暫存活，對軸突的再生作用效果較小;干擾凋亡信號通路如Caspase、RhoA/Rock、Nogo-A等雖然可以減少RGCs凋亡，但并不能增強軸突再生能力;通過抑制膠質細胞的活化以減少膠質瘢痕的形成和微環(huán)境產生，這雖然有利于軸突的再生，但對RGCs軸突的存活和再生數量難以保障。以上各種干預方法均未能達到有效促進RGCs軸突長距離生長和功能性恢復的效果。由此可見，視神經損傷后軸突的再生的障礙是多環(huán)節(jié)多因素共同作用的結

4、果，尋找具有多靶點作用的分子及綜合干預將是研究視神經損傷后功能性再生的重要方向之一。
　　α晶體蛋白(alpha crystallin)是小分子熱休克蛋白家族(small heat shock protein，sHsp)的一員，分為A型和B型。已有研究證實，α晶體蛋白作為應激性蛋白在抗炎、抗凋亡、抗蛋白聚集等方面發(fā)揮著重要作用，在視神經損傷方面對RGCs的存活和軸突再生具有非常好的生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，在視神經橫斷模型中，損傷的晶

5、狀體能刺激RGCs軸突的再生，且生長錐能到達位于上丘的視皮層.α晶體蛋白能通過RhoA/Rock信號通路促進RGCs的存活和軸突的生長，也能通過抑制小膠質細胞的激活和炎性因子TNF-α及iNOS的釋放保護節(jié)細胞的存活。這些研究提示α晶體蛋白可能是一個具有多靶點作用的分子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，αA晶體蛋白和αB晶體蛋白均能夠影響離體培養(yǎng)的腦源性星形膠質細胞的活化和增殖，細胞劃痕實驗也證實αA晶體蛋白或αB晶體蛋白處理后，星形膠質細胞的遷移

6、明顯被抑制，但αA晶體蛋白的效果更顯著。但具體原因尚不清楚。
　　BMP/Smad是調控中樞神經系統(tǒng)膠質細胞增殖、分化的關鍵信號通路。在脊髓損傷后，BMP2/4/7和pSmad1/5/8在少突膠質細胞、星形膠質細胞中的表達明顯增高。細胞培養(yǎng)提示，BMP4能促進神經干細胞分化成星形膠質細胞，當給予BMP4抑制劑Noggin后，星形膠質細胞的生成數量明顯減少。以上研究均證實BMP/Smad參與星形膠質細胞的活化、增殖、分化。在體外培養(yǎng)

7、的視乳頭區(qū)星形膠質細胞缺氧復氧的刺激后，BMP和BMPR的基因表達和蛋白水平均明顯增加，星形膠質細胞反應性增生，同時可檢測到α晶狀體蛋白表達增加，但兩者的相互關系尚不明確。
　　基于以上研究的背景我們提出如下假設:視神經損傷后反應性增生的星形膠質細胞被激活并形成的膠質瘢痕和抑制軸突再生的微環(huán)境是軸突難以再生的關鍵因素。αA晶體蛋白能減輕膠質瘢痕的形成和影響抑制微環(huán)境從而促進軸突的再生并改善視功能。而且αA晶體蛋白可能是通過BMP/

8、Smad信號通路而發(fā)揮作用。為此，在體內實驗中，我們建立大鼠視神經不完全損傷模型，同時給予玻璃體腔注射αA晶體蛋白(10-4g/l，4ul)，對照組給予同等劑量的PBS注射，運用IHC和WB技術觀察術后1天，3天，5天，14天視網膜和視神經GFAP表達變化，用同樣技術方法觀察術后14天TUJ1、GAP-43、CSPGs、Neurocan蛋白的表達變化，了解αA晶體蛋白對膠質瘢痕形成和軸突再生的影響。離體實驗中，分離培養(yǎng)視神經星形膠質細胞

9、，通過劃痕實驗、糖氧剝奪(OGD)實驗觀察αA晶體蛋白對星形膠質細胞遷移和激活的影響。通過RT-PCR檢測BMP/Smad信號分子的mRNA水平探討αA晶體蛋白影響星形膠質細胞活化的可能機制。為αA晶體蛋白下一步研究與運用提供更有力理論支撐。
　　本研究包含三個部分
　　第一部分、SD大鼠視神經不完全損傷后RGCs的變化及視網膜和神經損傷區(qū)星形膠質細胞活化的觀察
　　采用視神經輕度夾傷辦法建立視神經不完全損傷模型。我們

10、觀察到視神經損傷后3天RGCs即發(fā)生明顯的凋亡，損傷后14天RGCs的凋亡接近52％。視網膜和視神經星形膠質細胞被激活，術后1天GFAP表達即明顯增加，于術后14天時GFAP的表達達到最高水平。在視神經損傷區(qū)，星形膠質細胞大量的活化、增殖和遷移進入損傷區(qū)形成致密的膠質瘢痕。同時，電生理F-VEP的N1-P1幅值降低（5.24±1.67uV）和P1潛伏期延長（126.75±8.94ms），提示視神經損傷后RGCs減少、膠質細胞活化、視功能

11、嚴重受損。
　　第二部分:玻璃體腔注射αA晶體蛋白對視神經損傷后星形膠質細胞活化和RGCs軸突再生的影響。
　　視神經損傷后玻璃體腔注射αA晶體蛋白(10-4g/l，4μl))，對照組給予同等劑量的PBS注射。我們通過IHC和WB觀察視神經損傷區(qū)星形膠質細胞的形態(tài)和GFAP、CSPGs、Neurocan、TUJ1、GAP-43的表達變化發(fā)現(xiàn):αA晶體蛋白能明顯抑制視神經損傷區(qū)周圍的星形膠質細胞的活化和遷移，從而抑制膠質瘢痕的

12、形成。引導損傷區(qū)星形膠質細胞的重排，同時可以減少軸突再生主要抑制物CSPGs和Neurocan的表達。通過檢測TUJ1和GAP-43的水平，發(fā)現(xiàn)αA晶體蛋白能夠有效保護視神經TUJ1陽性突觸的存活，促進RGCs軸突的再生并使再生軸突穿過損傷區(qū)。F-VEP檢查發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，αA晶體蛋白能有效改善視神經損傷后大鼠F-VEP的N1-P1的幅值（對照組:5.83±2.64μV治療組:12.02±1.64μv）和P1的潛伏期（對照組:126

13、±9ms治療組:100±9ms），使部分視神經功能恢復。
　　第三部分:αA晶體蛋白影響視神經星形膠質增殖的分子機制研究
　　為進一步探討αA晶體蛋白影響視網膜星形膠質細胞的可能分子機制，我們對視神經星形膠質細胞進行分離培養(yǎng)。運用差速貼壁法獲得純度較高的視神經星形膠質細胞，運用細胞劃痕實驗觀察αA晶體蛋白(10-4g/l)對星形膠質細胞遷移的影響。結果顯示αA晶體蛋白能夠抑制星形膠質細胞的遷移。
　　利用糖氧剝奪模型（

14、Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）成功模擬視神經夾傷后的視神經損傷區(qū)星形膠質細胞的活化。將細胞分為對照組、OGD組、OGD+BSA組、OGD+αA晶體蛋白治療組。細胞免疫熒光(ICC)和WB分析GFAP和Neurocan的表達變化，發(fā)現(xiàn)OGD能刺激星形膠質細胞活化，使GFAP和Neurocan的水平升高，當給予αA晶體蛋白（10-4g/l）處理后，GFAP和Neurocan的水平明顯被抑制，觀察結果與體內實驗

15、結果相一致。我們通過對BMP/Smad各節(jié)點信號分子的基因表達檢測發(fā)現(xiàn)，αA晶體蛋白能抑制BMP2、BMP4及Smad1、Smad8的mRNA表達。結果提示，αA晶體蛋白可能通過BMP/Smad信號通路抑制視神經星形膠質細胞GFAP的表達和Neurocan的分泌。
　　結論:
　　1.視神經損后，一方面由于RGCs失去靶細胞提供的營養(yǎng)物質、凋亡信號通路的激活發(fā)生繼發(fā)性凋亡，另一方面視神經損傷刺激視網膜和視神經星形膠質細胞活化

16、形成膠質瘢痕，使RGCs軸突難以存活和再生。我們通過αA晶體蛋白玻璃體腔注射治療發(fā)現(xiàn)αA晶體蛋白不僅能保護RGCs軸突的存活，使部分F-VEP波形恢復，改善視神經傳導功能，還能有效抑制星形膠質細胞的活化和增殖，引導星形膠質細胞的重排，減弱膠質瘢痕的形成和減少抑制性分子CSPGs、Neurocan的表達，從而促進軸突的再生并使再生軸突穿過損傷區(qū)。這些發(fā)現(xiàn)，證實αA晶體蛋白是一種具有多靶點作用的分子，對視神經損傷后神經修復的治療具有廣闊的運