組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1在乳腺癌中的表達(dá)及功能學(xué)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在研究SETDB1在乳腺癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)情況，探討其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及生存預(yù)后的關(guān)系；若其在乳腺癌中特異性表達(dá)，再通過(guò)上調(diào)和下調(diào)SETDB1在乳腺細(xì)胞株中的表達(dá)，研究其對(duì)靶細(xì)胞功能學(xué)方面的影響。
　　方法：采用RT-PCR和IHC方法檢測(cè)SETDB1在38對(duì)乳腺癌及癌旁組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)；采用IHC組織芯片方法檢測(cè)150例乳腺癌組織中蛋白表達(dá)水平并分析預(yù)后情況；采用RT-PCR和WB方法檢測(cè)SETD

2、B1在14種乳腺細(xì)胞株（MCF-7、ZR75-1、T47D、ZR75-30、BT549、SK-BR3、HCC1937、Bcap37、Hs578T、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MDA-MB-231、BT474及HBL100，其中HBL-100為乳腺上皮細(xì)胞株，余均為乳腺癌細(xì)胞株）中的表達(dá)情況；利用慢病毒包裝和RNAi轉(zhuǎn)染技術(shù)在乳腺靶細(xì)胞株上高表達(dá)和沉默SETDB1，并通過(guò)RT-PCR和 WB方法驗(yàn)證干擾后SETDB1在mR

3、NA和蛋白水平的表達(dá)；篩選出的高表達(dá)和沉默的乳腺克隆細(xì)胞株，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其生長(zhǎng)增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移和侵襲能力，微球體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其干細(xì)胞形成能力，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡能力；所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用GraphPad Prism5.0和SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。
　　結(jié)果：
　　1.SETDB1在乳腺癌旁及癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況IHC結(jié)果顯示

4、，38例樣本中有23例（60.53％）癌組織，13例（34.21%）癌旁組織SETDB1陽(yáng)性表達(dá)（P<0.05）；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，38例乳腺癌與癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.20±0.08、0.96±0.05)（t=2.44，P<0.05）。
　　2.SETDB1150例乳腺癌組織芯片結(jié)果中有92例（61.33%）陽(yáng)性表達(dá)，56例（37.33%）陰性表達(dá)，SETDB1的蛋白表達(dá)與ER及Ki67的表達(dá)具有相關(guān)性（P=0.

5、001，P=0.035）；SETDB1的表達(dá)可作為乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)（COX回歸，HR=2.633，95%CI=1.189-5.829，P=0.017）。
　　3.以正常乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100作對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，13株乳腺癌細(xì)胞株中MCF-7、T47D的表達(dá)水平最高（7.86±0.42、6.43±0.12）（P<0.05）；WB結(jié)果顯示，MCF-7、T47D的相對(duì)表達(dá)水平較高（2.24±0.08、1.95±0

6、.10）（P<0.05）。
　　4.以靶細(xì)胞的GFP株對(duì)照，RT-PCR及WB檢測(cè)結(jié)果均顯示，HBL-100的克隆細(xì)胞株A1659和Z2656表達(dá)水平明顯增高（19.28±0.73、22.10±1.23）、（2.38±0.05、6.31±0.38）（P<0.05）；MCF-7克隆細(xì)胞株sh2和sh4的表達(dá)水平明顯降低（0.15±0.02、0.39±0.05）、（0.66±0.02、0.36±0.03）（P<0.05）；T47D的克

7、隆細(xì)胞株sh2和sh4的表達(dá)水平亦明顯降低（0.20±0.01、0.34±0.02）、（0.79±0.04、0.22±0.03）（P<0.05）。
　　5.高表達(dá)SETDB1的細(xì)胞株HBL-100的克隆細(xì)胞株A1659和Z2656對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖數(shù)量明顯增高，平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成數(shù)目增多，細(xì)胞周期S+G2/M期增高，細(xì)胞的遷移、侵襲和抗凋亡能力增強(qiáng)。
　　6.沉默SETDB1的細(xì)胞株MCF7和T47D的克隆細(xì)胞株s

8、h2和sh4對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖數(shù)量減少，平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成數(shù)目減少，細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期和/或G2/M期阻滯，細(xì)胞的遷移、侵襲能力減弱。
　　結(jié)論：
　　1.SETDB1在乳腺癌組織及細(xì)胞株中高表達(dá)，可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演癌基因角色并影響患者的預(yù)后生存情況，有望作為診斷和治療乳腺癌的一項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)。
　　2.SETDB1可能是腫瘤惡化和復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，所以SETDBl有望成為乳腺癌診斷，治療及預(yù)后的分子