EV71感染患兒T、B淋巴細(xì)胞及甲型H1N1流感肺炎患兒NO、IFN-γ、IL-17表達(dá)水平研究.pdf

1、第一部分EV71感染患兒T、B淋巴細(xì)胞表達(dá)水平研究
　　腸道病毒71型（EV71）是引起手足口?。℉FMD）及HFMD患兒神經(jīng)及呼吸系統(tǒng)等并發(fā)癥的主要病原體。EV71病毒感染嚴(yán)重的患兒可出現(xiàn)永久性的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥甚至死亡。EV71病毒是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后最主要的嗜神經(jīng)性病毒。近年來我國 HFMD疫情呈明顯上升趨勢(shì)，重癥病例不斷增加。同時(shí)由于 HFMD一旦在兒童密集地區(qū)爆發(fā)傳染率極高，重癥 HFMD病情變化極快，且伴隨嚴(yán)重并發(fā)癥，因

2、此受到社會(huì)各界的高度關(guān)注。目前EV71病毒感染的致病機(jī)理仍未明確，尚未見針對(duì)HFMD的有效疫苗和抗病毒藥物，但是眾多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，HFMD患者的免疫功能存在異常，HFMD的發(fā)病及疾病的嚴(yán)重程度與 T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的表達(dá)及功能密切相關(guān)。目前國內(nèi)外少數(shù)研究顯示 EV71病毒感染可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，但對(duì)于免疫應(yīng)答在 EV71病毒感染發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚不清楚，既往關(guān)于EV71病毒感染患兒T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的研究以及各亞群

3、間相互關(guān)系的研究極少，因此研究這兩類細(xì)胞亞群在 HFMD發(fā)病中的作用機(jī)制以及各細(xì)胞亞群間的相互關(guān)系，可深化對(duì) HFMD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為其臨床診治以及判斷預(yù)后提供新的思路。
　　目的：分析 EV71感染患兒外周血中 T細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表達(dá)水平，T細(xì)胞亞群的特征性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，探討T細(xì)胞亞群之間、T細(xì)胞亞群與轉(zhuǎn)錄因子間的相互關(guān)系，以

4、及它們?cè)贖FMD中的發(fā)病機(jī)制及作用；了解 EV71感染患兒外周血中 B淋巴細(xì)胞及 B10細(xì)胞的表達(dá)水平，確定 EV71感染患兒外周血 B10（IL-10+CD19+）細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能，探討其在EV71感染患兒中的重要作用及臨床意義。
　　方法：研究對(duì)象為2014年11月至2015年7月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心收治的EV71感染患兒32例，手足口病診斷均符合衛(wèi)生部制定的《手足口病診治指南（2010年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，咽拭子 EV7

5、1病毒核酸檢測(cè)及 EV71病毒培養(yǎng)陽性并排除其他兒童常見病原體感染。對(duì)照組32例，咽拭子 EV71病毒核酸檢測(cè)陰性，收集64例實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臨床資料及外周血標(biāo)本。利用流式細(xì)胞術(shù)觀察患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中 T細(xì)胞亞群（ Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表達(dá)水平，B淋巴細(xì)胞及B10細(xì)胞的表達(dá)水平；利用RT-PCR方法分析EV71感染患兒及健康對(duì)照者外周血中 T-b

6、et、Gata3、RORγt、Foxp3、TCF-1、Bcl-6 mRNA的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，兩組間比較正態(tài)分布時(shí)采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ X±S）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差不齊性或數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí),釆用非參數(shù)檢驗(yàn)中的 Mann-Whitney U檢驗(yàn),結(jié)果表示為均值及四分位數(shù)間(25％-75%)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析應(yīng)用 Pea

7、rson相關(guān)性檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，EV71組 CD3+T、Th（CD3+CD4+）、Tc(CD3+CD8+)細(xì)胞明顯下降； EV71組 Th1（ IFN-γ+CD3+CD4+）、 Tc1(IFN-γ+CD3+CD8+)、Treg(CD4+CD25hiCD127low)與對(duì)照組相比明顯降低，Th2（IL-4+CD3+CD4+）、Tc2（IL-4+CD3+CD8+）、Th17（ IL-17+CD3+CD4+）、Tc17（

8、IL-17+CD3+CD8+）、Tfh（ IL-21+CD3+CD4+）、IL-21+CD3+CD8+、CD19+、B10(IL-10+CD19+)細(xì)胞與對(duì)照組相比明顯升高；與對(duì)照組相比 EV71組 RORγt、Bcl-6、TCF-1的 mRNA表達(dá)量升高， T-bet、Gata3、Foxp3的 mRNA的表達(dá)量降低；EV71組中 Thl與 Treg、Tfh與 IL-21+CD3+CD8+、Thl7與 Tfh、Treg與 Thl7細(xì)胞表

9、達(dá)在 EV71組中呈正相關(guān)關(guān)系，在對(duì)照組中無相關(guān)性； Thl與中性粒細(xì)胞、Th2與Treg細(xì)胞在EV71組中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，在對(duì)照組中無相關(guān)性；Thl與 Tc1、Thl7與 RORγt表達(dá)在 EV71組和對(duì)照組均呈正相關(guān)關(guān)系；EV71感染患兒外周血中 Th1/Th2比值較對(duì)照組明顯下降,Th17/Treg比值較對(duì)照明顯升高。
　　結(jié)論：
　　1. EV71感染患兒外周血 T淋巴細(xì)胞表達(dá)總體下調(diào)，在 T淋巴細(xì)胞亞群中 Th2

10、、Tc2、Th17、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，Th1、Tc1、Treg細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)，說明各T細(xì)胞亞群在EV71病毒的致病過程中各自發(fā)揮不同的作用。
　　2. EV71感染患兒B淋巴細(xì)胞及B10細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，提示B淋巴細(xì)胞及B10細(xì)胞可能與HFMD的病情進(jìn)展有關(guān)。
　　3. EV71感染患兒存在Th1/Th2和Th17/Treg的比值失調(diào),這種失調(diào)可能在感染的病理生理過程中起作用。
　

11、　4. EV71感染患兒Thl與Treg、Tfh與IL-21+CD3+CD8+、Thl7與Tfh、Treg與Thl7細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，Thl與中性粒細(xì)胞、Th2與 Treg細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明這些細(xì)胞亞群間相互影響，彼此聯(lián)系。
　　5. EV71感染患兒轉(zhuǎn)錄因子 T-bet、Gata3、Foxp3、RORγt、TCF-1、Bcl-6的 mRNA表達(dá)量存在異常，提示其可能在轉(zhuǎn)錄水平影響機(jī)體的抗病毒反應(yīng)。
　　第二部分

12、甲型H1N1流感肺炎患兒NO、IFN-γ及IL-17表達(dá)水平研究
　　甲型 H1N1流感病毒可引起一種新型呼吸道傳播疾病。通過飛沫、氣溶膠、直接接觸或間接接觸傳播,臨床主要表現(xiàn)為流感樣癥狀,少數(shù)病例病情重,進(jìn)展迅速,可出現(xiàn)病毒性肺炎,合并呼吸衰竭、多臟器功能損傷,嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡。自2009年3月暴發(fā)于墨西哥后，迅速在全球范圍內(nèi)蔓延。由于流感病毒的變異性大，感染后發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。
　　目的:本文通

13、過探討甲型H1N1流感肺炎患兒一氧化氮（nitric oxide，NO）含量及細(xì)胞因子水平與機(jī)體免疫狀態(tài)的關(guān)系及其檢測(cè)的臨床意義?？偨Y(jié)其特點(diǎn)，以期為甲型H1N1流感肺炎的診治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)
　　方法:2009年7月至12月于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心住院的甲型H1N1流感肺炎患兒，發(fā)病初期（3天內(nèi)）采集咽拭子，應(yīng)用熒光定量 RT-PCR法檢測(cè)其感染病原學(xué)情況，選取甲型H1N1流感病毒（influenza AH1N1virus）陽性

14、且未合并其它兒童常見病原體感染的肺炎患兒30例為病例組；同期保健門診體檢兒童30例為對(duì)照組，RT-PCR法檢測(cè)其H1N1及兒童常見病原體核酸陰性。所有入組兒童留取血清及 EDTA抗凝全血標(biāo)本，應(yīng)用 Griess法測(cè)定各組兒童血清總 NO和亞硝酸鹽（NO2-）含量；ELISA法檢測(cè)各組兒童血清細(xì)胞因子IFN-γ及IL-17水平；并采用四色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩組兒童進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞各亞群檢測(cè)。
　　結(jié)果:甲型H1N1流感肺炎患兒血清中總N

15、O含量、NO2-水平及IL-17水平較對(duì)照組均顯著升高（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而血清IFN-γ水平與對(duì)照組相比有所降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。另外，甲型H1N1流感肺炎患兒外周血CD3+、CD3+CD4+ T淋巴細(xì)胞比例以及CD56+CD16+ NK細(xì)胞比例均明顯下降（P<0.05）；CD19+ B淋巴細(xì)胞比例則顯著升高（P<0.01）；而CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞以及CD4-CD8--雙陰性（double ne