miR-200s調(diào)控 CAFs細胞活化及活性維持并促進細胞外基質(zhì)重塑介導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、第一章 miR-200及其靶基因TCF12和Fli-1通過調(diào)節(jié)乳腺癌CAFs細胞的活化和細胞外基質(zhì)重塑促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：探索miR-200s使CAF活化，調(diào)控ECM蛋白的異常沉積，并促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：（1）原代分離獲得乳腺癌病人來源的正常成纖維細胞（NF:Normal fibroblast）和腫瘤相關(guān)成纖維細胞（ CAF：Cancer-associated fibroblast）。（2）

2、qRT-PCR檢測這20對NF和CAF細胞中miR-200s的表達。（3）利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，將乳腺癌細胞與NF細胞共培養(yǎng)，qRT-PCR檢測miR-200s的表達。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實驗確定miR-200s的靶基因。(5)利用shRNA和基因過表達技術(shù)，驗證miR-200s及其靶基因促進CAF的活化。（6）利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實驗驗證miR-200s

3、及其靶基因?qū)CM重塑的影響（7）癌細胞侵襲實驗和裸鼠成瘤模型驗證miR-200s及其靶基因促對乳癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：（1）原代培養(yǎng)獲得20對成對的乳腺癌病人來源的NF和CAF細胞。（2）qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s在CAF中下調(diào)的真實性和普遍性。（3） qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)癌細胞共培養(yǎng)激活的 NF細胞中miR-200s表達下調(diào)。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實驗表明TCF12和Fl

4、i-1分別是miR-141和miR-200b的靶基因。(5)利用shRNA和基因過表達技術(shù)，發(fā)現(xiàn)低表達miR-200s的NFs具有活化的CAFs的特征，CAF活化標志物?-SMA、FAP表達增加，其遷移侵襲能力增強；CAFs中恢復(fù)miR-200s的表達，部分抑制CAF功能并出現(xiàn)NF表型特征。（6）利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實驗驗證miR-200s及其靶基因通過調(diào)控下游一系列ECM成分相關(guān)基因，尤其是FN和LOX

5、的表達，促進ECM重塑。（7）體內(nèi)裸鼠實驗和臨床病例研究更進一步證實miR-200s及其靶基因?qū)AF活化、ECM重塑、乳癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)論：（1）下調(diào)的miR-200s導(dǎo)致細胞分化相關(guān)的靶轉(zhuǎn)錄因子Fli-1和TCF12異常表達，促進乳腺癌CAFs活化。（2）miR-200s及其靶基因Fli-1和TCF12介導(dǎo)了乳癌微環(huán)境ECM重塑，促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。揭示CAFs促進乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的新的分子機制，為靶向腫瘤微環(huán)境的治療

6、提供新靶點。
　　第二章離體CAFs活化的自我維持
　　目的：探索miR-200s維持CAF的活化狀態(tài)及機制。
　　方法：（1）5’-aza處理CAF細胞，qRT-PCR檢測miR-200s的表達。（2）Western Blot檢測成對NF和CAF細胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達差異。（3）利用基因干擾技術(shù)，沉默CAF細胞中Dnmt3b的表達，qRT-PCR檢測miR-200s的表達。（4）qRT-PCR、Western Bl

7、ot和雙熒光素酶驗證miR-200b/200c的靶基因Dnmt3b。（5）TGF-β1處理CAF后，qRT-PCR檢測miR-200s的表達，Western Blot檢測Dnmt3b及miR-200s的靶基因TCF12和Fli-1的表達。
　　結(jié)果：（1）5’-aza處理CAF細胞，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-200s表達增加。（2）Western Blot結(jié)果顯示CAF細胞中Dnmt3b表達明顯高于NFs。（3）qRT-PCR結(jié)果

8、顯示沉默CAF細胞中Dnmt3b的表達，miR-200s表達增加。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶結(jié)果顯示Dnmt3b是miR-200b/200c的靶基因。（5）qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理CAF細胞，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s下調(diào)，撤離外源性TGF-β1并正常培養(yǎng)CAF細胞，miR-200s持續(xù)低表達；而Western Blot結(jié)果顯示Dnmt3b表達增加，同時靶基因TCF12和Fli-1的