幽門螺桿菌感染胃上皮細(xì)胞模型的建立及長鏈非編碼RNA NR_026827與胃癌的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是誘發(fā)胃癌的重要因素，但H.pylori感染誘發(fā)胃癌的分子機制尚不清楚。此外，關(guān)于胃癌診斷核酸標(biāo)記物的報道較少。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄長度超過200 nt、不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，它可在不同層面上調(diào)控基因表達(dá)水平進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程，是良好的研究腫瘤發(fā)生機制和進(jìn)行腫

2、瘤診斷的分子標(biāo)記物。然而，目前關(guān)于lncRNA用于H.pylori誘發(fā)的胃癌診斷和胃癌發(fā)生機制研究的報道較少。為此，本論文旨在建立H.pylori感染胃上皮細(xì)胞的模型，以篩選有望用于胃癌診斷的潛在lncRNA標(biāo)記物，并初步探討lncRNA與胃癌的相關(guān)性。
　　方法：
　?。?）H.pylori感染胃上皮細(xì)胞實驗。
　　按常規(guī)微需氧方法培養(yǎng)H.pylori NCTC11637標(biāo)準(zhǔn)菌株，用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)胃上皮

3、U937細(xì)胞。然后將不同濃度的H. pylori（100:1 MOI和300:1 MOI）加入到U937細(xì)胞中，感染U937細(xì)胞不同時間（8 h，24 h和48 h）。同時，用等量的PBS代替H. pylori加入到細(xì)胞溶液中作為對照組。通過顯微鏡觀察U937細(xì)胞形態(tài)的變化，應(yīng)用流式液相多重蛋白定量（CBA）技術(shù)檢測細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ和TNF的濃度變化情況，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)

4、行細(xì)胞凋亡檢測，以確定H. pylori感染胃上皮細(xì)胞合適的菌量和時間，確定最佳實驗條件。
　?。?）H.pylori感染后的胃上皮細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜差異分析。
　　采用康成公司的Human LncRNA Array v3.0（8×60K）芯片，對H.pylori感染后的U937細(xì)胞組和正常U937細(xì)胞組進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析。對lncRNA雜交芯片圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行聚類分析及相關(guān)性分析，獲得l

5、ncRNA的差異表達(dá)譜，以表達(dá)量差異兩倍為界篩選 H. pylori感染后的胃上皮細(xì)胞表達(dá)差異的lncRNA。
　　（3）LncRNA NR_026827在臨床標(biāo)本中的表達(dá)量差異驗證及與胃癌發(fā)展的相關(guān)性分析。
　　為了驗證經(jīng)上述細(xì)胞實驗成功篩選到的lncRNA NR_026827在臨床樣本中的表達(dá)差異情況，利用qRT-PCR方法比較lncRNA NR_026827在H.pylori感染后的U937細(xì)胞實驗組和正常U937細(xì)胞

6、對照組中的表達(dá)量。并進(jìn)一步用qRT-PCR法比較lncRNA NR_026827在40例胃癌樣本和對應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析lncRNA NR_026827在胃癌不同分期中的表達(dá)量情況。
　　結(jié)果：
　?。?）H.pylori感染胃上皮細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ偷慕ⅰ?br>　　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，H. pylori感染細(xì)胞的時間不能超過24 h，濃度不能超過100:1 MOI，時間過長或濃度過大均會引起細(xì)胞發(fā)

7、生顯著的凋亡和壞死；進(jìn)一步對細(xì)胞因子濃度分析后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子 IL-6在實驗組中的濃度比對照組中的濃度顯著升高，且在H.pylori濃度為100:1 MOI時，IL-6在H.pylori感染細(xì)胞24 h時濃度達(dá)到最高；流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，100:1 MOI的H.pylori處理細(xì)胞24h，不會引起細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡或壞死。因此，確定用MOI為100：1的H.pylori菌量感染胃上皮細(xì)胞24小時是進(jìn)行后續(xù)基因芯片實驗的最佳條

8、件。
　?。?）H.pylori感染后的胃上皮細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜差異分析。
　　利用基因芯片技術(shù)對H.pylori感染后的胃上皮細(xì)胞實驗組和正常細(xì)胞對照組進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)2倍以上的上調(diào)的lncRNA有79個，下調(diào)的lncRNA有52個，其中差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)5倍以上的上調(diào)的lncRNA有9個，下調(diào)的lncRNA有10個。但在差異倍數(shù)達(dá)5倍以上的19個lncRNA中，18個lncRNA的基因

9、芯片雜交信號較弱，說明其表達(dá)量較低，只有一個 lncRNA（NR_026827），其差異倍數(shù)高達(dá)4841.34，且芯片雜交信號較強，達(dá)315135.25。
　?。?)LncRNA NR_026827在臨床標(biāo)本中的表達(dá)量差異驗證及與胃癌發(fā)展的相關(guān)性分析。
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，在H. pylori感染的細(xì)胞樣本中l(wèi)ncRNA NR_026827的表達(dá)和芯片的結(jié)果一致。在臨床胃癌組織樣本中也檢測到了lncRNA NR_02

10、6827的表達(dá)，且與癌旁組織相比其表達(dá)顯著降低，結(jié)果與細(xì)胞實驗中 lncRNA NR_026827經(jīng) H.pylori感染后的表達(dá)顯著降低一致。這些結(jié)果表明lncRNA NR_026827可望成為診斷胃癌的潛在生物標(biāo)記物。我們進(jìn)一步對lncRNA NR_026827的表達(dá)量與胃癌分期的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示 lncRNA NR_026827在胃癌不同分期中表達(dá)量無明顯差異，說明lncRNA NR_026827可能參與了胃癌整個發(fā)生發(fā)

11、展過程。
　　結(jié)論：
　?。?）成功建立了H.pylorii感染感染胃上皮細(xì)胞的實驗?zāi)Ｐ停訫OI為100：1的H. pylori菌量感染胃上皮細(xì)胞24小時，既能讓細(xì)胞保持較完整的形態(tài)，也能觀察到細(xì)胞因子IL-6的顯著變化。
　?。?）獲得了H.pylori感染后的胃上皮細(xì)胞lncRNA的差異表達(dá)譜，篩選到了可能對于胃癌發(fā)生發(fā)展具有重要作用的lncRNA NR_026827。
　　（3）LncRNA NR_026