納米金棒-MUC1適配體復(fù)合物的構(gòu)建及其靶向識別研究.pdf

1、【研究背景】
　　肺癌是危害人類生命健康的常見疾病，其發(fā)病率和死亡率高居常見腫瘤之首。大部分肺癌患者因癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多已進(jìn)展至晚期，傳統(tǒng)放療、化療等手段治療效果不佳，新興的靶向藥物及免疫調(diào)定點阻滯劑在肺癌患者治療中表現(xiàn)出持續(xù)獲益，但均存在其局限性，在肺癌的診斷及治療領(lǐng)域要有新的突破需尋求新的靶向治療策略。納米金棒（AuNRs）具有獨特的生物相容性、表面修飾和功能化、高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability

2、 and retention,EPR)、表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)等理化及生物性質(zhì)，在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域展示出巨大應(yīng)用前景,通常將表面修飾的AuNRs結(jié)合靶向分子構(gòu)建具有主動靶向功能的AuNRs復(fù)合載體廣泛應(yīng)用于分子成像、靶向載藥、放療增敏、光熱治療等腫瘤診斷及治療領(lǐng)域。核酸適配體是一種通過指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Lig

3、ands by Exponential Enrichment,SELEX)從隨機單鏈核酸序列庫中逐層篩選擴增出的能特異性與靶標(biāo)結(jié)合的小片段DNA或RNA，與傳統(tǒng)抗體相比，具有高親和性、免疫原性弱、易于大規(guī)模合成、易于體外修飾、易于穿透腫瘤組織等性質(zhì)，成為理想的靶標(biāo)分子。黏蛋白-1(Mucin-1，MUC1)是一種分布在呼吸道、腺體導(dǎo)管、胃腸道等上皮細(xì)胞表面的高度糖基化黏蛋白，研究已表明它與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞生長、腫瘤細(xì)胞遷移等過程密切

4、相關(guān)，發(fā)生癌變時在細(xì)胞表面異常高表達(dá)，且暴露其核心肽上的相關(guān)抗原表位，使其成為一種廣譜靶標(biāo)分子。為充分發(fā)揮AuNRs和核酸適配子的高效性，可考慮通過SELEX技術(shù)篩選出能與肺癌細(xì)胞表面高表達(dá)的MUC1蛋白具有高度親和性的MUC1適配體(MUC1-aptamer)，并將MUC1適配體與表面修飾的AuNRs連接構(gòu)建一種新的具有主動靶向功能的復(fù)合物，應(yīng)用于肺癌的早期診斷及治療領(lǐng)域的研究，探究肺癌細(xì)胞對這種復(fù)合物的攝取機制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向

5、藥物運載、在人體組織投射窗口予近紅外激光照射等相關(guān)的靶向殺傷研究，以期為肺癌的新型靶向診療平臺提供理論基礎(chǔ)，為肺癌的早期診斷和治療提供新的思路。
　　【研究目的】
　　1.如何通過嚴(yán)格控制實驗條件，調(diào)節(jié)納米金粒子縱橫比以合成在525nm和近800nm波長處具有雙SPR峰的AuNRs；
　　2.篩選并合成能與肺癌A549細(xì)胞系表面高表達(dá)的MUC1蛋白具有高度親和的MUC1-aptamer；
　　3.在成功合成前兩步

6、目標(biāo)物質(zhì)基礎(chǔ)上構(gòu)建具有主動靶向功能的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物；
　　4.探究所構(gòu)建的新型靶向AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物與高表達(dá)MUC1蛋白的肺癌A549細(xì)胞系結(jié)合、攝取特點，對比納米金棒被動靶向性的優(yōu)勢所在；
　　5.探究給予人體組織投射窗口的近紅外激光照射對靶向結(jié)合AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物的A549細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。
　　【研究方法】
　　1．改變AgNO

7、3、CTAB、抗壞血酸(ascorbicacid,AA)的濃度，調(diào)整納米金粒子縱橫比，通過金種子法誘導(dǎo)生長法(Seed-mediated growthmethods)合成在525nm和近800nm波長處具有雙向SPR峰的AuNRs，并進(jìn)一步通過紫外分光法測定驗證，所得AuNRs置于4℃保存?zhèn)溆茫?br>　　2.選取對MUC1蛋白核心肽具有高親和性的適配體S2.2作為目標(biāo)MUC1核酸適配體，并在單鏈MUC1-aptamer的5’端修飾巰基

8、以結(jié)合AuNRs，在3’端修飾6’-FAM熒光基團作為特異性結(jié)合靶細(xì)胞的檢測標(biāo)記，通過質(zhì)譜檢測驗證合成目標(biāo)適配體的序列正確性及純度；
　　3.通過納米金棒的快速修飾法(rapid modification at low pH。RMLP)高效快速地將合成的巰基化MUC1-aptamer修飾連接AuNRs，并使用納米金比色法、紫外分光法對所構(gòu)建的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物的物理特性進(jìn)行表征及驗證；
　　4.將所構(gòu)

9、建的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物分別與傳代培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞系及對照組肝癌HepG2細(xì)胞系孵育，流式細(xì)胞儀檢測及熒光顯微鏡觀察復(fù)合物與細(xì)胞的靶向結(jié)合與攝入，細(xì)胞表面熒光強度代表靶向復(fù)合物結(jié)合細(xì)胞的效率；
　　5.利用AuNRs的近紫外區(qū)吸收峰及光熱轉(zhuǎn)換特性，使用近紅外光分別對與AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物和AuNRs孵育后的靶細(xì)胞進(jìn)行照射，并使用MTT比色法檢測對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，細(xì)胞存活率的大小

10、與其孵育的藥物毒性相關(guān)。
　　【結(jié)果】
　　金種子誘導(dǎo)生長法所合成納米金棒通過紫外分光光度計法檢測其紫外吸收波譜，在波長525nm和近800nm近紅外光處可見雙重等離子共振峰，即為目標(biāo)所需AuNRs；將合成的巰基化MUC1-aptamer通過快速修飾法對AuNRs進(jìn)行修飾，合成AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物，通過納米金的比色法和紫外分光光度計法檢測紫外吸收波譜，可知靶向復(fù)合物構(gòu)建成功，且該靶向復(fù)合物在波長525n

11、m和近800nm近紅外光處仍有可見雙重等離子共振峰；構(gòu)建的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物與A549細(xì)胞孵育后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表面熒光強度顯著高于其他各組，同時使用流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞表面熒光強度，其熒光強度是AuNRs處理對照組5倍，差異顯著，在肝癌HepG2細(xì)胞系未見明顯差異，認(rèn)為構(gòu)建的靶向復(fù)合物與肺癌A549細(xì)胞系表現(xiàn)為特異性結(jié)合；分別與AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物、AuNRs孵育的靶細(xì)胞經(jīng)近紅外光

12、照射后，MTT比色法測定吸光值并算出各組細(xì)胞存活率，得出靶向復(fù)合物組+A549細(xì)胞組較陰性對照組及HepG2細(xì)胞系對照組細(xì)胞存活率明顯降低，差異顯著(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　綜合分析本課題各部分結(jié)果得出：本研究成功構(gòu)建了基于AuNRs和MUC1-aptamer結(jié)合的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物，該靶向復(fù)合物具有AuNRs的物理化學(xué)特性和適配子的靶向性，并能對細(xì)胞表面過表達(dá)MUC1蛋白的肺癌A549細(xì)