新型防御素類雜合肽對THC8307結腸癌細胞系的作用研究.pdf

1、目的：利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫人工設計合成新型防御素類雜合肽，并研究新型肽對腫瘤細胞的抗腫瘤作用及作用機制，為臨床發(fā)現(xiàn)療效更高、毒性更小的抗腫瘤新藥提供指導。
　　方法：1.利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫篩選出具有抗腫瘤作用的人LL-37、HNP-1、蛙皮素Maximin1和Dermaseptin-B2抗菌肽，經(jīng)Genbank、DNASTAR生物信息學軟件分析，選取結構合理、理論上活性最佳的抗菌肽氨基酸序列并進行個別氨基酸的置換，增加抗菌肽的靜電荷數(shù)，

2、合成新型的雜合抗菌肽。
　　2.采用ProtParam、Antheprot軟件和chembio office2008分析新型防御素類雜合肽的理論等電點、親水性、不穩(wěn)定性等性質，并對肽的二級結構進行預測模擬。
　　3.用不同濃度的新型防御素類雜合肽處理人肺癌細胞（A549）、人結腸癌細胞（THC8307）、嗜鉻神經(jīng)細胞瘤（PC12），分別作用24h、48h后終止刺激，采用實時阻抗細胞分析技術（RTCA）實時監(jiān)測細胞活力狀況，M

3、TT法檢測細胞毒性。
　　4.取一條新型防御素類雜合肽（5號肽）處理人結腸癌細胞（THC8307），研究其抗腫瘤的作用機制，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察與細胞的親和能力，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡情況，蛋白質免疫印跡法（WB）檢測細胞相關凋亡蛋白的表達含量變化。
　　結果：1.設計合成了5條新型防御素類雜合肽。
　　2.5條新型防御素類雜合肽的基本性質及參數(shù)均符合高效抗菌肽的特性，抗菌肽序列由30多個

4、氨基酸組成縮減至17或18個氨基酸，有效降低了抗菌肽的合成成本。
　　3.通過實時阻抗細胞分析技術（RTCA）觀測發(fā)現(xiàn)新型防御素類雜合肽處理腫瘤細胞后細胞生長指數(shù)明顯下降；MTT法檢測發(fā)現(xiàn)其能有效抑制細胞增殖水平且呈劑量依賴性。
　　4.熒光染料FITC標記的新型防御素類雜合肽處理人結腸癌細胞（THC8307）24h，激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）下觀察顯示雜合肽成功進入細胞內(nèi)；流式細胞術檢測探究新型防御素類雜合肽對人結腸

5、癌細胞的作用機制，抗菌肽處理組細胞早期凋亡和晚期凋亡細胞明顯增高，單倍體G0/G1期細胞百分率明顯下降，而處于S期細胞百分率相應增高(P<0.05)，但抗菌肽+廣譜caspase酶抑制劑處理組細胞凋亡情況同對照組差異不明顯(P>0.05)。表明新型防御素類雜合肽抑制細胞向雙倍體G2/M期分裂期發(fā)展分化，遏制細胞停留在S期，從而抑制腫瘤細胞惡性增生；蛋白質免疫印跡法（WB）檢測細胞蛋白水平，抗菌肽處理組細胞caspase8、9，Activ

6、e caspase3蛋白含量增加，而Pro capase3,Bcl-2蛋白含量相應減少，表明新型防御素類雜合肽主要通過誘導細胞發(fā)生凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用的。
　　結論：成功設計合成了具有抗腫瘤活性的新型防御素類雜合肽,其抗腫瘤作用研究表明新型防御素類雜合肽有效降低了腫瘤細胞的活性；進一步研究表明新型防御素類雜合肽可以通過細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖來發(fā)揮抗腫瘤作用，將有望應用于腫瘤疾病的治療，為臨床抗腫瘤藥物研發(fā)提供新的